2006年诺贝尔医学奖

2006年诺贝尔医学奖演讲人：魏玮RNA干扰机制一获奖者简介安德鲁·法尔(AndrewFire)·1959年出生于美国加利福尼亚州圣克拉拉县·1983年获美国麻省理工学院生物学博士学位·现任斯坦福大学斯坦福医学院病理学和遗传学教授克雷格•梅洛（CraigC.Mello）·1960年出生于美国·1990年获得哈佛大学生物学博士学位·现任美国哈佛大学马萨诸塞州医学院分子医学教授二RNAi机制1.RNAi背景●RNAinterference由双链RNA（DoubleStrandRNA简称dsRNA）指导的，在特定酶参与下，以外源或内源mRNA为降解目标，在转录后水平上使特异性靶基因发生的沉默现象●生物界普遍存在的一种古老而进化的高度保守的生物学现象●存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物的大多数真核生物中，原核生物暂未发现2.RNAi的发现☆1990年，科学家RichJorgensen将产生紫色素的基因置于一个强启动子后导入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，但结果是：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色。当时认为这是导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制，并将之称为协同抑制☆1995年，康奈尔大学的SuGuo博士在用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现：反义RNA（antisenseRNA）和正义RNA（senseRNA）都阻断了基因的表达☆1998年，AndrewFire和CraigMello将反义RNA和正义RNA同时注射到秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）比单独注射反义RNA诱导基因沉默的效率高10倍3.RNAi机理3.1dsRNA的形成◆基因组中DNA反向重复序列的转录产物◆DNA同时转录了反义RNA和正义RNA的互相结合◆病毒RNA复制中间体◆以细胞中单链RNA为模板，由细胞或病毒的RNA在有关酶的催化下合成dsRNA等3.2siRNA(干扰性小RNAsmallinterferingRNA，简称siRNA)的形成▲RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员▲含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构3.21核酸内切酶Dicer（1）dsRNA在细胞中大量扩增（2）dsRNA在细胞中达到一定量时，核酸内切酶Dicer识别并与之结合形成酶-dsRNA复合体（3）核酸内切酶Dicer对siRNA进行切割，产生21-23nt长的dsRNA小片段，即siRNA3.22siRNA形成过程3.23siRNA的特征性结构：※siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性※siRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基※正义链与反义链各有21个碱基，其中19个碱基配对，在每条链的3′端都有2个不配对的碱基（图1）。图1siRNA示意图3.3RISC的形成和发挥效应siRNA和核糖核酸酶复合物结合，形成RNA诱导的基因沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,简称RISC）3.32RISC蛋白成分内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶、同源RNA链搜索活性酶、Argonaute等3.31RISC的形成☆Argonaute有一个月牙型的底座由三部分组成，分别为N-端（amino-terminal）、中部（middle）和PIWI区域（PIWIdomain）。月牙底座上面有一个PAZ部分，由茎杆结构支撑。Argonature蛋白有一个凹槽贯穿整个蛋白，凹槽内壁带正电有利于与RNA带负电的磷酸骨架结合3.33Argonaute蛋白☆RISC的特有成分，被比喻成“切薄片的机器”。图2siRNA引导mRNA被切割的模型(1)RISC中的siRNA依赖ATP水解释放的能量而解旋，双链转变成单链而使复合体被激活，得到活性RISC。(2)siRNA解旋后，siRNA单链的3’端伸入PAZ的裂缝中，整个单链沿着PAZ伸展开，同时目的片段mRNA结合于新月型底座。siRNA反义链与mRNA互补区域结合，形成双链(3)在离单链siRNA5’端9个碱基处,由RNA酶切割mRNA，阻断RNA的翻译，达到在RNA水平上干扰基因表达的效果3.33效应阶段紫色正义RNA段蓝色反义RNA段绿色目标信使RNA图4RNAi原理示意图：siRNA形成后另外作为一种特殊引物,在RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，简称RdRp)作用下以靶mRNA为模板合成dsRNA,后者在Dicer酶的作用下又可被降解形成新的siRNA，新生成的siRNA再进入上述循环3.34siRNA特殊的保障机制——随机降解性多聚酶链式反应3.5siRNA目标位点的筛选(1)在预定沉默的mRNA中找一段21nt的序列，起始是AA(2)找2～4个小片段的RNA，通过SECs（siRNAexpressioncassettes，简称SECs）筛选最有效的siRNA(3)在19nt的RNA片断中不能含有连续4个T或A的区域(4)通过BLAST确定片断的特异性；(5)片断GC%应该在30%～50%1.开展基因治疗的新途径一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因表达同时降低的表现，也可同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。三RNAi的应用＊抗肿瘤治疗RNAi可用于抑制癌基因的表达＊传染性疾病根据病原体如病毒、细菌等的致病基因序列，以及生物体内与疾病发生相关的基因序列，设计和制备与这些基因序列有同源序列的dsRNA，转入动植物内使有关的疾病基因“沉默”，从而达到治疗的效果。＊AIDS治疗利用siRNA抑制病毒再生或传染所需的蛋白质的生成。优势在于能够不损伤细胞而只抑制病毒蛋白质。＊动物实验证明，通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默”。＊美国哈佛医学院的科学家成功地利用RNA干扰技术治愈了实验鼠的肝炎。2.功能基因组的研究＊由于RNAi具有高度的序列专一性，可以准确地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，这样当某一特定基因被“沉默”后，其功能便反向的体现出来＊RNAi能够在哺乳动物中降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间，控制基因表达的部位四未解难题★RNA干扰在患者体内的有效部位进行★是否会影响目标基因以外的其他基因，引发副作用ThankYou！