KPC酶研究进展

革兰阴性菌感染约占50%碳青霉烯类抗生素是最后一道防线碳青霉烯类抗生素耐药现象日益严重碳青酶烯酶碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类β内酰胺酶,它包括Ambler分子分类为A、B、D三类酶碳青霉烯酶的分类水解底物酶抑制物Ambler分子分类Bush分群酶青霉素一、二代头孢三代头孢氨曲南a亚胺培南aEDTAb克拉维酸bA2fNMC+++++-+IMI+++++-+SME+++-++-+KPC+++++-+GES+++-+--+B3IMP+++-++-VIM+++-++-GIM+++-++-SPM+++-++-D2dOXA+++--+--+-注：a：+，强水解（kcat2s-1）；+-，弱水解（0.5s-1kcat2s-1）；-，不水解（kcat0.5s-1）b：+，抑制；+-，不确定；-，不抑制碳氢酶烯酶分类酶最常见的细菌ClassAKPC,SME,IMI,NMC,GES肠杆菌科(铜绿中报道较少)ClassB(金属-b-内酰胺酶)IMP,VIM,GIM,SPM铜绿假单胞菌肠杆菌科细菌不动杆菌属ClassDOXA不动杆菌属KPC-11996年Yigit在美国北卡罗来纳州一株对碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌中发现，由质粒介导的碳青霉烯酶KPC-1(K.pneumoniaecarbapenemase-1,KPC-1)KPC-1耐药表型表现出高度亚胺培南和美罗培南耐药性(MIC都为16μg/ml)氨基酸序列分析显示,KPC-1与SME-1、NMC-A、IMI-1分别有45%、44%、43%的相似性（SME-1、NMC-A、IMI-1之间的氨基酸相似性90%），可能是KPC-1与这3种酶不是由同一基因分化而来AntimicrobAgentsChemother.2001Apr;45(4):1151-61.KPC-22002年报道，Yigit等在一株对多种β-内酰胺类药物和亚胺培南耐药的肠炎沙门菌检检出KPC-2酶。2003年，又报道了在一株产酸克雷伯菌中检测到KPC-2酶2008年Yigit在AAC上进行修正说明，认为KPC-1的650-652的碱基（编码174位氨基酸）由文献上报道的AGC（编码丝氨酸）更正为GGC（编码甘氨酸）由此得出结论，KPC-1和KPC-2是同一种酶等电点是6.7AntimicrobAgentsChemother.2003Dec;47(12):3881-9AntimicrobAgentsChemother2008;52:809.KPC-32000年4月至2001年4月，纽约TISCH医院的ICU病房有24名病人被感染了亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌，这是首次报道碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌引起的医院性感染PFGE证实了此次医院感染是由3个不同的克隆株引起PCR扩增发现了一种新的KPC酶——KPC-3，由75kb的质粒编码，可以接合转移KPC酶KPC-3和KPC-2相比有1个碱基的改变以后的文献又陆续报道了KPC-4、KPC-5和KPC-6氨基酸结构序列研究显示，KPC-5、KPC-6被认为是KPC-2到KPC-4的过度体KPC酶之间核酸、氨基酸的差异308位碱基（103位氨基酸）716位碱基（239位氨基酸）814位碱基（272位氨基酸）KPC-2C(脯氨酸)T(缬氨酸)C(组氨酸)KPC-3C(脯氨酸)T(缬氨酸)T(酪氨酸)KPC-4G(精氨酸)G(甘氨酸)C(组氨酸)KPC-5G(精氨酸)T(缬氨酸)C(组氨酸)KPC-6C(脯氨酸)G(甘氨酸)C(组氨酸)KPC酶KPC酶之间的关系：KPC-4KPC-5KPC-2KPC-3KPC-6KPC-4KPC酶据文献报道，3种KPC酶都需要合并膜孔蛋白OmpK35的缺失,引起细菌对碳青霉烯类药物耐药肠杆菌科头孢菌素酶+膜孔蛋白缺失碳氢酶烯酶+/-膜孔蛋白缺失铜绿假单胞菌膜孔蛋白缺失泵出增强碳氢酶烯酶不动杆菌属头孢菌素酶+膜孔蛋白缺失碳氢酶烯酶+/-膜孔蛋白缺失KPC酶的传播KPC酶的传播机制还不是完全清楚有限的DNA指纹和脉冲凝胶电泳资料显示与医院感染有关。最早在美国、特别在美国的东北部各州蔓延，并造成局部地区暴发流行。以后几年再世界各地都有报告。KPC酶的传播研究认为，blaKPC位于一种新型的Tn3型的转座子Tn4401上，其转座子的结构是KPC基因转移的原因这种新型的转座子结构可以使blaKPC从其原始位置转移至各类不同的质粒同时认为转座子Tn4401是一个复合转座子，由2次序列插入形成KPC酶的传播Iskpn6位于blaKPc下游，Iskpn7位于blaKPc上游，ISKpn6和ISKpn7可能编码转移酶tnpA和tnpR分别编码转移酶IRL和IRR有39bp构成最外面的靶位复制点（TSD）由5-bpATTGA组成接合实验肺炎克雷伯菌（A1500）、肺炎克雷伯菌（A1500）和粘质沙雷菌S1筛选实验成功，筛选出其接合子，无丙二酸盐枸橼酸杆菌（C1）筛选实验失败，没有筛选出接合子等点聚焦电泳证明实验菌和接合菌都有pI为6.7的β-内酰胺酶产KPC酶菌株及其接合菌的药敏结果StrainMIC(μg/ml)aAKGMCIPMCTTZTLCPTCIPETPCPSTXC125625632256256256256/2256/43232256256A15001.01.0321248256256/2256/43232256256A1500c1.00.750.12561232256/2256/4226448K11.016816256256256/2256/43232256256K1c1.00.750.12561232256/2256/4226448S121.00.1962424256/2256/4886464S1c1.50.750.0644248256/2256/41.01.54832ATCC259221.00.50.0080.030.060.120.120.0080.12ATCC352188/22/4肠杆菌科细菌中的KPC菌种注解克雷伯菌属源于肺炎克雷伯菌的暴发流行源于产酸克雷伯菌的散在发生肠杆菌属散在发生大肠埃希菌沙门菌属弗劳地枸橼酸杆菌沙雷菌属铜绿假单胞菌–哥伦比亚&波多黎各两株肺炎克雷伯菌的RAPD分析对上海地区分离的肺炎克雷伯菌（A1500）和浙江地区分离的肺炎克雷伯菌（K1）做随机扩增的多态性DNA（RAPD）分析，证明两株菌株不是同一克隆型疾病与治疗KPC-producingorganismshavebeenimplicatedinavarietyofinfectionsincludingbacteremia,ventilator-associatedpneumonia,urinarytractinfection,andcentralvenouscatheterinfection.Selectionofantibiotictherapyshouldbetailoredtoantimicrobialsusceptibilityresultsforagentsoutsidethebetalactamandcarbapenemclasses.Inaddition,antibioticsusceptibilitytestingshouldberequestedfortigecycline,colistinandaztreonam.危险因素Useofbroadspectrumcephalosporinsand/orcarbapenemsisanimportantriskfactorforthedevelopmentofcolonizationorinfectionwithKPC-producingorganisms,KPC酶的检测实验室检测产KPC菌株问题:1)一些菌株表现为低水平的碳氢酶烯类抗生素耐药，甚至敏感2)有些自动化系统尚不能发现低水平耐药Imipenem0204060≤1248163232MIC(mg/ml)No.ofIsolates产KPC菌株对亚胺培南的敏感性S*IR12%的检测菌株对亚胺培南敏感产KPC菌株对美罗培南的敏感性Meropenem0501002481616MIC(mg/ml)No.ofIsolatesS*IR9%的检测菌株对美罗培南敏感产KPC菌株对厄他培南的敏感性01020304050602481616MIC(mg/ml)No.ofIsolatesSIR检测菌株中，无一株细菌对厄他培南敏感产KPC菌株对三代头孢的敏感性肠杆菌科–特别是对于那些耐超广谱头孢菌素类抗生素的肺炎克雷伯菌151株产KPC菌株的MIC范围头孢他啶32to64mg/ml头孢曲松≥64mg/ml头孢噻肟≥64mg/ml菌株对头孢西丁和头孢吡肟的敏感性可变实验室当前的工作厄他培南是检测KPC酶的最佳底物建议将厄他培南列为常规药敏试验的品种对所有具有ESBLs/AmpC酶样表型（即对第三、第四代头孢菌素耐药）的肠杆菌科细菌都要怀疑产KPC酶，最好进行Hodge试验KPC酶的检测方法采用改良的Hodge试验，PCR直接检测KPC酶的基因。改良Hodge试验0.5麦氏浊度单位大肠埃希菌ATCC25922涂布MH平板中间贴亚胺培南（10μg）纸片接种待检菌的无菌接种环自纸片外缘向平板边缘划线35℃过夜培养结果判断：亚胺培南抑菌圈内出现待检菌矢状生长者为产碳青霉烯酶菌株EcoliATCC25922改良Hodge试验改良Hodge试验发现KPC的敏感性高达100%;其它碳氢酶烯酶存在时试验也呈阳性特异性90%Leeetal.CMI,7,88-102.2001.PCR扩增及测序KPC结构基因对上述细菌PCR检测KPC基因，无丙二酸盐枸橼酸杆菌（C1）、肺炎克雷伯菌（A1500）显示948bp左右条带，阳性对照是浙江二院赠送的产KPC-2的肺炎克雷伯菌。经测序，Blasting比对证实，为KPC-2基因KPC–问题如果发现菌株产KPC，是否应该将碳氢酶烯类抗生素敏感的结果改为耐药?CLSI建议：报告MIC值，但不报告“S”或者报告“R”、“I”任选其一SUMMARYKPC属于classA类β-内酰胺酶对包括超广谱头孢菌素类和碳青霉烯类在内的所有β-内酰胺类抗生素耐药KPC酶最常见于肺炎克雷伯菌也曾有过报道:产酸克雷伯菌,弗劳地枸橼酸杆菌,肠杆菌属某些种,大肠埃希菌,沙门菌属某些种,沙雷菌属,在铜绿中也曾有过报道（哥伦比亚）SUMMARYKPC酶位于质粒上;接合和非接合blaKPC两侧通常携带转座子序列报道过的质粒blaKPC常伴有:一般β-内酰胺酶超广谱β-内酰胺酶氨基葡糖苷类耐药质粒介导的氟喹诺酮耐药SUMMARY如果临床菌株对第三、第四代头孢菌素“R”，厄他培南≥2μg/ml（19-21mm)*亚胺培南、美罗培南2-4μg/ml（16-21mm)应进行改良Hodge试验对碳氢酶烯类抗生素敏感而Hodge试验（+）的菌株，CLSI建议：报告MIC值，但不报告“S”