2015版中国药典_药品微生物检查解析

药品微生物检查本课件是结合《中国药典》2010年版与2015年版通则微生物内容第三次公示稿(2014-09-28发布)进行讲解。网址：年版微生物学检验中的重大修订及意义1、实验环境的重大修订①无菌检查环境洁净度规定②微生物限度检查环境洁净度规定2、培养系统的重大修订①无菌检查中培养基的修订②微生物计数法中培养基的修订③控制菌检查法中控制菌的修订④抑菌效力测定法中培养基的修订3、对一、二、三部微生物学附录的整合、修订2015年版微生物学检验中的重大修订及意义与USP35版、EP7.0版、JP16版比较，2015年版中国药典微生物学检验体系规划收载的项目和内容已基本趋向一致，将使我国药典的微生物学检验成为一个比较完备的标准体系，其意义在于：1、全面与国际药典标准接轨；2、从对终产品的检验向过程控制转变。药品微生物检查1、无菌检查法2、非无菌产品微生物限度检查–非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法–非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法–非无菌药品的微生物限度一、无菌检查法1.总则：环境、设备、人员2.培养基：品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查3.稀释液、冲洗液：品种、制备、灭菌4.方法适用性试验：直接接种法、薄膜过滤法5.供试品的无菌检查：供试品的处理、对照试验、直接接种法、薄膜过滤法、培养及观察6.结果判断1.总则•1）对象：–无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。一、无菌检查法1.总则•2）环境：–应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，（《9203药品微生物实验室质量管理指导原则》:环境洁净度B级背景下的局部A级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行）【10版：应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行】，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。–A级和B级区域的空气供给应通过终端高效空气过滤器（HEPA）。一、无菌检查法1.总则•2）环境：–单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》（GB/T16292、16293、16294-2010）现行国家标准进行洁净度确认。–隔离系统应定期按相关的要求（【15版《9206无菌检查用隔离系统验证指导原则》】）进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。一、无菌检查法1.总则•3）人员：–【10版：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。】–15版删除。一、无菌检查法2.培养基一、无菌检查法内容2010版2015版培养系统硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基选择性培养基0.5%葡萄糖肉汤培养基营养肉汤培养基营养琼脂培养基改良马丁琼脂培养基硫乙醇酸盐流体培养基胰酪大豆胨液体培养基中和或灭活用培养基0.5%葡萄糖肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基沙氏葡萄糖肉汤培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基2.培养基•硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养。•胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。•1）培养基的制备及培养条件–配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌–制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境–若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。一、无菌检查法2.培养基•2）培养基适用性检查•无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。•本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。一、无菌检查法2.培养基•2）培养基适用性检查①无菌性检查:•每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。②灵敏度检查–菌种•试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。•菌液：浓度100cfu/ml•接种：2管+菌液，1管空白•结果判断：+菌液----生长良好空白----无菌生长一、无菌检查法②培养基灵敏度检查金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨液体（琼脂）培养基【10版：营养肉汤培养基或营养琼脂培养基】30~35℃18h~24h铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基白色念珠菌沙氏葡萄糖液体（琼脂）培养基【10版：改良马丁（琼脂）培养基】20~25℃【10版：23-28℃】24h~48h黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基或用适宜方法制成孢子悬液【10版：改良马丁琼脂斜面培养基】5d~7d菌液制备:取菌种新鲜培养物接种至相应培养基，培养。上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。一、无菌检查法•培养基接种:取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支,分别接种相应菌液。逐日观察结果。一、无菌检查法金黄色葡萄球菌各2支硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃3d铜绿假单胞菌生孢梭菌空白1支枯草芽孢杆菌各2支胰酪大豆胨液体培养基【10版：改良马丁培养基】20～25℃5d白色念珠菌黑曲霉空白1支•结果判定:空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。②培养基灵敏度检查4.方法适用性试验（方法验证试验）•当进行产品无菌检查法时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。•验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。•方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。一、无菌检查法5.供试品的无菌检查•无菌检查法包括–薄膜过滤法–直接接种法•只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。•供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。•无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。一、无菌检查法•阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：–无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；–抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；–抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；–抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。–阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100CFU，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。–阳性对照管培养48～72小时应生长良好。•阴性对照供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。一、无菌检查法5.供试品的无菌检查1.薄膜过滤法–薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。【10版删除：可用一般薄膜过滤器】。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm。直径约为50mm。–根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。【10版删除：抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。】使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。一、无菌检查法5.供试品的无菌检查1.薄膜过滤法–水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。–供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。–略：不同供试品的过滤方法。增加：具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品一项一、无菌检查法5.供试品的无菌检查2.直接接种法–直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。–除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的支/瓶数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1。–除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。一、无菌检查法5.供试品的无菌检查•培养及观察–将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置30～35℃培养，一份置20～25℃培养。–培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。一、无菌检查法5.供试品的无菌检查•结果判断–阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。–若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。一、无菌检查法5.供试品的无菌检查•结果判断–当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：•（1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。•（2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。•（3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。–试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。一、无菌检查法5.供试品的无菌检查一、无菌检查法一、无菌检查法一、无菌检查法一、无菌检查法微生物限度检查法《中国药典》2015年版修订后将分为三个附录：–1、非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法–2、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法–3、非无菌药品微生物限度标准二、非无菌产品微生物限度检查1.1总则：环境、要求1.2计数方法：平皿法、薄膜过滤法、最可能数法（MPN法）1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查、计数方法适用性试验、1.4供试品检查：检验量、供试品检查1.5结果判断1.6稀释液、冲洗液及培养基二、非无菌产品微生物限度检查1.非无菌产品微生物限度检查：----微生物计数法•微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。•当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。•本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。二、非无菌产品微生物限度检查1.1总则：1.1总则：•环境：–微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。(在不低于GMP现行版要求的D级洁净环境、局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内】。–检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。–单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。二、非无菌产品微生物限度检查1.1总则：•如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时,若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。•供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性