实验二通课2012-3

实验二通课鲎试验（两人一支）肠道致病菌分离培养——S-S培养基8个/室细菌的分布与消毒灭菌1.空气、咽喉部、手指、紫外线2.其中血平板2个/室，普通平板6个/室3.高压蒸气灭菌法（两个实验室一台高压锅）4.手指消毒：肥皂洗手、碘酒、酒精一、内毒素的检测内毒素生物学活性：致热作用、白细胞反应、感染性休克和DIC等。内毒素检测的应用：（1）检测输液用品或生物制品中是否含有内毒素（2）临床上检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引起的内毒素血症（内毒素休克）等检测内毒素的方法有家兔发热法和鲎实验法，家兔发热法比较烦琐，且灵敏度不高，故现在多用鲎实验法，鲎实验法灵敏度高，可检测小于10ng/ml的内毒素。原理鲎（hòu）是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。内毒素（LPS）激活凝固蛋白原凝固蛋白（溶解状态）（凝胶状态）凝固酶原凝固酶材料鲎试剂鲎试剂溶解水内毒素试剂无菌注射器方法及结果方法：1.取两支鲎试剂打开，分别加入0.1ml鲎试剂溶解水，振摇使之完全溶解。2.其中一支加入0.1ml内毒素，标记为实验组，另一支加入0.1ml溶解水，标记为对照组。3.垂直放入37℃温箱，20--30分钟观察结果。结果：实验组出现凝固，对照组不出现凝固二、细菌在自然界的分布及理化因素对细菌的影响1.空气中细菌的检查（每个班1个平皿）原理：根据空气中携带有微生物气溶胶（以固体或液体微小颗粒分散于空气中的分散体系称为气溶胶，其中的气体是分散介质）粒子在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上。方法：在室内选择一处放一个平皿。揭开皿盖，皿盖扣置于皿底下，暴露放置15min，即盖上皿盖，放入37℃培养24小时，观察结果。细菌在自然界的分布2.咽喉部细菌的检查（每班2个平皿）取血琼脂平板1块，打开平皿盖，将培养基面置于口腔前10cm处，受试者用力咳嗽几次；盖上平皿盖，置37℃温箱中倒置培养24h后取出观察结果。细菌在自然界的分布2、物理因素对细菌的影响（1）高压蒸汽灭菌在1.05kg/cm2(103.425KPa)的压力下，温度达到121.3℃，维持15—30min，可杀灭包括细菌芽胞在内的一切微生物适用于耐高温高压并且不怕潮湿的物品，如敷料、手术器械、药品和细菌培养基等手提式高压蒸汽灭菌器(1)准备：向锅内加水至水位标记线为止。将准备灭菌的培养基及空玻璃器皿用牛皮纸包好，装入锅内套层中，物品放置不宜过多，过挤，锅内应留出三分之一空间。然后盖严锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，打开锅盖上的放气阀。(2)加热：接通电源，开始加热。至有均匀白色水蒸汽冒出为止，以排净锅内冷空气。关闭排气阀，继续加热。当压力表上升到所需压力（一般为1.05kg/cm2或103.425KPa）时，开始计算灭菌时间。此时应适时关闭热源，不断调节热源大小，使压力始终维持在所需数值上，达到保压时间后停止加热，使灭菌锅内压力自然下降。(3)结束：待压力表降至“0”时，拧松螺旋，半开锅盖，用锅内余热烘干包装纸，10分钟后取出灭菌物品。注意事项：（1）在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。（2）由于高压蒸汽灭菌时，要使用高温高压蒸汽，操作时，必须严格按照操作规程操作，否则容易发生意外事故。（2）紫外线对细菌生长的影响：紫外线为非电离辐射，波长在240—280nm的紫外线具有杀菌作用，其中波长265—266nm的紫外线杀菌能力最强，这与DNA吸收光谱范围一致其杀菌原理是，紫外线易被核蛋白吸收，使DNA的同一条链上或者两条链上位置相邻的胸腺嘧啶形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰DNA的复制，导致细菌死亡或者变异。另，紫外线通过空气时，可使空气中的氧气电离产生臭氧，加强了杀菌作用紫外线杀菌作用强，而穿透能力弱。取普通琼脂平皿，用密涂法接种细菌，然后取一无菌滤纸片将平皿部分遮盖，用紫外线照射30min，然后将纸片拿开，放入37℃温箱中孵育24h后观察（滤纸片用过后烧掉）。同样方法进行玻璃遮盖法实验。有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，称为化学消毒剂；浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂；只能外用，对细菌的敏感性不同。化学消毒剂对细菌的影响化学消毒剂对细菌的影响方法：取一普通平皿培养基，一部分写上“前”，另一部分写上“后”，然后将手指在写有“前”的部分沾一下，再将手指用酒精进行消毒，在写有“后”的部分沾一下。放入37℃温箱培养24小时后观察。（每个实验室4个平皿）三、致病性肠道杆菌的分离与鉴定粪便生化反应SS琼脂平板（双糖含铁培养基）（必要时进行增菌培养）得出结论革兰染色菌落观察挑取可疑菌落纯培养血清学鉴定⑴观察菌落特征⑵取可疑菌落做革兰染色⑶将细菌接种于两支双糖铁培养基上，37度培养24小时，观察结果⑷做血清学实验（玻片凝集）⑸给出结果和鉴定依据致病性肠道杆菌的分离与鉴定常见致病性肠道杆菌（1）大肠杆菌生物学性状:G-镜下为杆状营养要求不高，可在普通琼脂培养基上生长最适宜温度为37℃，最适宜pH为7.4（2）伤寒杆菌生物学特性:G-镜下为杆状营养要求不高，可在普通琼脂培养基上生长最适宜温度为37℃，最适宜pH为7.4大肠杆菌：圆形，凸起，灰白色，表面光滑，湿润伤寒杆菌：圆形，无色，半透明菌落特点肠道杆菌的生化反应乳糖发酵试验初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌肠道致病菌肠道非致病菌多数不发酵乳糖多数发酵乳糖SS培养基含有胆酸盐抑制G+,枸橼酸钠和煌绿能部分抑制大肠杆菌,致病的沙门菌和志贺菌能大量生长.含有中性红指示剂和乳糖,中性红遇酸变粉红.常用于培养肠道致病菌.SS培养基上各菌的生长特点大肠杆菌：粉红色大菌落伤寒杆菌：无色细小半透明菌落福氏痢疾杆菌：无色细小半透明菌落双糖铁培养基的特点含有乳糖和葡萄糖：产酸产气含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成硫化氢，可形成黑色沉淀酚红指示剂：酸：黄碱：红用于观察细菌是否产生硫化氢及对糖的发酵能力1)大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验）,是斜面及底层均呈黄色并有气泡。2)沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖,不发酵乳糖,分解葡萄糖产的酸使培养基pH下降,酚红指示剂变黄,但是培养基中的葡萄糖仅有0.1%,在斜面的酸性物质被氧化成挥发性酸,且细菌氧化氨基酸物质产生的氨的中和作用,使斜面变红,而底层则为黄色。另沙门菌分解含硫氨基酸，有黑色沉淀。双糖铁培养基上各菌的生长特点原理:颗粒性抗原(未知细菌)+已知抗体(诊断血清)材料：伤寒血清、待检菌方法:操作同血浆凝固酶实验（将血浆换成伤寒血清）结果:凝集+，待测菌为伤寒杆菌不凝集-，待测菌不是伤寒杆菌玻片凝集反应将粪便标本以分区划线法接种到SS培养基。(每个实验室8个平板）(接种好后，做好标记，用胶布按班绑好)放入37℃温箱中培养24小时。取出放4℃冰箱中保存备用。分离培养方法预习下周内容：肠道杆菌的鉴定、药敏实验、抗酸染色