ECL发光

ECL发光zdhECL化学发光检测试剂•ECL化学发光检测试剂是基于Luminol的新一代增强型化学发光底物试剂，它由辣根过氧化物酶（HRP）催化发生化学反应，发出荧光，结果可以通过X光片压片和其他显影技术展现或使用Luminometer检测。溶液A主要成分为Luminol及特制发光增强剂。溶液B主要成分为H2O2及特殊稳定剂。ECL显色原理•发光液A和B在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在发光过程中不需要消耗HRP,HRP只是起催化作用，所以只要HRP没降解失活,是可以重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶,在室温放置时间过长,是会降解的；同时在发光过程中有什么物质(比如显影液)污染了膜的话,也有可能灭活膜上的HRP。ECL化学发光•化学发光ECLWesternBlotting，主要是依据检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种分析方法ECL化学发光•酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。也就是常常用来标记二抗的HRP和AP。•HRP的发光底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸（HPA）。•AP的发光底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物），CDP-STAR。•化学发光底物用于免疫印迹技术已有十几年的历史，目前大部分实验室做转印时都会采用化学发光技术进行检测。应用及储存•ELISA•Western&Far-WesternBlot•DotBlot•SouthernBlot•NorthernBlot•A液和B液2-8℃避光分别保存，保质期一年。ECl操作的基本程序如下1、进行常规电泳、转膜、HRP标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。2、新鲜配制发光工作液：分别取等体积溶液A和B混合，放置使之升到室温否则会减弱荧光强度。建议立即使用工作液，室温放置数小时后仍可使用，但灵敏度略有降低。3、用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液，但勿使膜完全干燥。将膜完全浸入并与发光工作液充分接触。4、用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。5、在X光胶片暗盒内面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将杂交膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹杂交膜，去除气泡和皱褶，用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖杂交膜的保鲜膜固定在暗盒内，6、在黑暗中放入X光胶片，分别曝光不同的时间如数秒到数分钟。显影冲洗。发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免。Westernblot---ECL•早先WesternBlot主要采用同位素标记•后来酶促反应比同位素安全且快速，逐渐成为WesternBlot的主流检测方法。•酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen•随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，甚至还有Femto级别的，灵敏度超过了同位素注意事项•注意事项：1.ECL工作液配制过程中吸取试剂A和试剂B时务必更换Tip头，工作液新鲜配制后立即使用，放置过久会影响灵敏度。2.根据蛋白丰度不同曝光时间可能是数秒至数小时。3.曝光时间过长会使背景加深，曝光不足会导致条带模糊。4.如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL发光和曝光。5.应使用高质量保鲜膜。发光液理想的发光液：•发光灵敏，目前一般的发光增强剂都可以将发光灵敏度提高1000倍至100000倍以上，可以检测pmol甚至fmol级别的HRP，发光的灵敏度实际上已不是问题。•发光稳定，这是目前研究的重点之一，发光不稳定的增强剂，容易在一些情况下发生“淬灭”，即快速消耗发光试剂，在几秒钟内发强光，又在几秒钟内迅速消逝，不容易被检测的现象。•本底或背景低，这是发展的方向之一，由于化学发光反应对增高本底的因素很敏感，因此，化学发光分析欲得到准确可靠的结果，就必须确保试剂的特异性，在无HRP或很少HRP的情况下，不发光或很少发光。问题•问题一.发光液用DAB显色好还是用ECL好？一般的，DAB主要用于免疫组化显色，然后在显微镜下观察；ECL组要用于westernblot，内含过物氧化酶作用底物，化学发光由暴光底片感光，并用于结果分析。做WESTERN-BLOTECL的敏感性比DAB染色要强的多。问题•问题二：信号弱•解决方法：•(1)优化一抗和二抗的工作浓度；•(2)增加曝光时间，如必要可过夜曝光；•(3)更换亲和力更高的抗体；•(4)检查两种ECL试剂是否交叉污染。问题•问题三.背景很脏是什么原因？1.没有洗干净（使用PBST或者TBST）2.一抗浓度过大，可以降低一抗浓度3.二抗浓度过大4.封闭时间短5.抗体稀释液效果不好问题•问题：有杂信号•解决方法：•(1)优化一抗和二抗的工作浓度；•(2)缩短一抗孵育时间；•(3)增加一次洗涤，并延长洗涤时间至10min；•(4)减少样品上样量；•(5)更换特异性更高的二抗。问题•问题四.同一张膜如何进行蛋白的反复检测？使用膜修复液洗15-30分钟，再用PBST或TBST洗3×10min。然后再封闭，加一抗。一般每张膜可以反复检测4-5次。不同膜情况•NC膜是通过疏水作用来和蛋白质相连，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。•PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，虽然也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。ECL公司•Luminol是经典的HRP化学发光底物。GEHealthcare（原安玛西亚）的ECL堪称是经典。除了拥有王牌产品ECL的GE公司，化学发光底物方面不得不提到Pierce公司。Pierce拥有世界上最优秀的HRP化学发光底物生产技术——世界上许多知名的化学发光底物试剂盒厂商都采用PIERCE提供的化学发光底物作为生产原料。其中最耀眼的璀璨之星是SuperSignal系列。•SuperSignal灵敏度高（有10{-12}g级，10{-14}g级，10{-15}g级选择），发光持久（6-24小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏6个月，4℃至少是12个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释倍数是同类产品的10倍以上，这对于宝贵一抗来说十分重要）。