OsRACK1)的功能研究 - 扬州大学

水稻RACK1基因（OsRACK1）的功能研究姓名：曹丹丹导师：梁建生一、本研究目的及意义水稻是全世界的主要农作物之一，现有120多个国家和地区培育种植。仅在亚洲就有20亿人从稻米及其副产品中摄取60%-70%的所需能量。我国以占世界7%的耕地养活占世界23%的人口，其中水稻作为我国第一大粮食作物，从事稻作生产的农户接近农户总数的50%，全国有60%以上的人口以稻米为主食(KhushGS.,1997)。水稻对我国粮食安全作出了巨大贡献。专家预计，至2030年，我国稻谷年需求量将达2.56亿吨至2.72亿吨，但目前国内水稻年总产量刚刚接近2亿吨，因此到2030年，我国稻谷年产量必须比现在再增产6000万吨左右。而要挖掘稻谷增产的潜力，重要途径之一是提高单位面积产量。提高水稻单位面积产量途径之一是在不断挖掘高产种质资源的基础上，不断提高水稻在不良生长环境下产量潜力的发挥。渗透胁迫是影响水稻生长发育，最终导致产量降低的最主要的环境胁迫之一(Boyer,1982)。在我国，盐渍土分布范围广，面积大，约占我国耕地面积的10%。由于大量盐渍化土壤的存在，使得相当大的一部分水稻，因受不同程度盐害的影响而使产量难以提高，使优良的水稻品种的增产潜力难以发挥。同时随着全球气候变暖，干旱加剧，水资源日渐缺乏。以我国现有的水资源，难以支撑传统水稻的进一步发展。急需开展水稻节水栽培技术及相关抗旱性的基础研究，培育抗旱、高产、优质的水稻品种。由于非生物逆境的复杂性，使人们在改良作物抗非生物逆境方面的结果并不理想。随着分子生物学的发展，应用分子遗传学途径和转基因技术可望阐明水稻抗逆的分子机理，提高水稻的抗逆境能力。研究相关基因功能的最重要途径之一是筛选其突变体并对其功能进行分析(LossofFunctionAssay)。我们从拟南芥植物中筛选到一个耐渗透胁迫的突变体，Atrack1。二、RACK1的发现RACK1最早在动物中发现，近年来，在许多包括植物和菌类在内的真核生物中都发现了哺乳动物RACK1基因的同源基因。第一个植物RACK1基因克隆自烟草BY-2悬浮细胞，是一个生长素诱导基因，之后在紫花苜蓿、油菜、番茄、拟南芥等植物中先后克隆到RACK1基因，并且发现所有植物RACK1蛋白氨基酸序列与哺乳动物RACK1蛋白具有约75%的相似性。以拟南芥为例，拟南芥的RACK1基因仅含有1个约600个碱基的内含子，蛋白长度约为384个氨基酸，分子量为35784D，在所有组织中均见表达（Vahlkamp,2000）。Guo等人（2007）认为大部分植物物种RACK1基因不止一种，而动物等其他物种则只有一种RACK1基因。Chen等人（2006）在拟南芥基因组中发现了三种RACK1蛋白编码基因，分别命名为RACK1A、RACK1B、RACK1C，认为这三种蛋白均属于WD-40重复蛋白家族，并以Gβ结构为模板，构建了RACK1A的7叶片β螺旋桨结构模型。哺乳动物RACK1作为支架蛋白而起作用，可同时与许多信号分子相互作用，从而调节不同的信号转导途径（McCahilletal.,2002），如细胞周期的调控（Mamidipudietal.,2004），Ca2+的释放(Pattersonetal.,2004)，核糖体的组装（Cecietal.,2003;Sunguptaetal.,2004；Nilssonetal.,2004），细胞骨架的重构（Osmanagic-MyersandWiche,2004）等。植物细胞中RACK1是否具有支架蛋白的功能还未知，但由于植物RACK1蛋白氨基酸序列与动物RACK1蛋白高度相似，并且含有动物RACK1蛋白的结构功能域，包括WD-40重复的数目和位置、蛋白激酶C的结合位点等，说明植物RACK1蛋白至少具有动物RACK1蛋白的部分功能。另外，由于植物RACK1基因最早是作为烟草BY-2悬浮细胞的一个生长素诱导基因而被发现的，由此推测植物RACK1蛋白可能在生长素介导的细胞分化过程中起作用（Guoetal.,2007）。同时，由于RACK1蛋白与G蛋白β亚基具有类似的WD-40重复结构，而这一结构又在不同的生物中具有很强的保守性，推测这一结构可能对生物具有十分重要的作用。三、RACK1与G蛋白的关系前人的研究也表明，拟南芥G蛋白可能与植物的渗透胁迫信号的转导过程有关(Wangetal.,2001)，本研究组从拟南芥中筛选到的rack1突变体具有较高的耐逆性，也暗示着RACK1蛋白可能参与渗透胁迫信号转导过程。拟南芥植物中的RACK1蛋白与从烟草BY-2悬浮细胞中分离到生长素响应基因ARCA编码的蛋白高度同源。RACK1蛋白是一类属含有WD40重复蛋白家属的亚家属。拟南芥中研究最多的是G蛋白的β亚基，研究表明，拟南芥的G蛋白的β亚基参与了多种的细胞信号转导过程。对RACK1蛋白和G蛋白的β亚基氨基酸序列进行比对发现两者具有很高的同源性(大于87%)，并且两者具有类似的空间结构。Gβγ和RACK1的结构模型以AtRACK1蛋白的氨基酸序列为模板对水稻基因组序列进行比对，我们找到两个与编码AtRACK1蛋白高度同源的基因。在蛋白质水平两者与AtRACK1蛋白的同一性和相似性分别达到70%和80%。推测水稻的RACK1(OsRACK1)可能与拟南芥RACK1(AtRACK1)具有相似的功能。四、RACK1蛋白的结构RACK1蛋白属于一类含有WD-40重复结构蛋白家族的亚家族。WD-40重复蛋白是一类大的蛋白质家族，结构高度保守，广泛分布于真核生物和原核生物中，目前已鉴定到140多种蛋白属于WD-40重复蛋白家族。这类蛋白在多种生物生命活动过程中扮演非常重要的角色，如细胞信号转导、蛋白转运、细胞骨架的组装和解聚、RNA的加工、染色质的修饰及转录、细胞分裂、胞浆移动、细胞凋亡、光信号转导、细胞运动、开花、花序的发育以及分生组织的形成等。每个WD重复蛋白包含40-60个氨基酸，WD结构域的N端一般是由Gly-His(GH)二肽组成的11到24个氨基酸残基，它的C端含有Trp-Asp(WD)二肽。最初RACK1蛋白被确定为蛋白激酶C(PKC)的受体，现在认为RACK1蛋白作为支架蛋白在多个信号转导途径中起重要作用。五、本实验室的研究现状李大红博士等以粳稻日本晴为研究材料，首先通过RT-PCR技术及T-A克隆法克隆了蛋白编号为（NP-916988）的OsRACK1基因，构建水稻OsRACK1基因的过表达和抑制表达载体，再通过农杆菌介导的植物转化方法导入水稻，得到过表达和抑制表达OsRACK1基因的转基因水稻植株。并对T1代的种子萌发和幼苗在逆境胁迫下进行生理测定，对RACK1参与的信号转导机理进行研究，从而为全面揭示OsRACK1基因的功能奠定基础。AB过表达转基因水稻RNAi转基因水稻李大红博士等的研究中所构建的植物表达载体pCAMBIA1301/R中包含有能在植物中表达的与35S启动子和Nos终止子相连的GUS报告基因，可作为目的基因转化水稻细胞筛选的标记。对经潮霉素抗性筛选获得的T0代转基因水稻幼苗进行GUS组织化学分析表明，GUS基因已经转化入水稻基因组中。再通过转基因植株的PCR检测证明RACK1基因已转入．CK1234567CK10ABabab李大红博士等对转基因水稻植株在盐胁迫和干旱胁迫下进行了功能分析，证明RACK1在水稻的抗盐抗旱中确实发挥了一定的调控作用。我的实验目的是要筛选出转基因的纯合体植株并对osRACK1蛋白的功能进一步的分析和osRACK1蛋白与其它蛋白的相互作用。