基因工程-第一章绪论

基因工程GeneticEngineering遗传学实验室三大重中之重高技术•生物技术（BT)•信息技术（IT）•新材料技术（纳米技术，NT）ChapterI概论•基因工程的概念–概念–与生物工程、生物技术的关系•基因工程的诞生与发展–理论上的三大发现–技术上的三大发现–发展过程中的重大事件•基因工程研究的主要内容–基本步骤–基因克隆需要的工具和技术•基因工程的意义1基因工程的概念1.1概念广义基因工程：DNA重组技术的产业化设计与应用。•上游技术：外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（狭义基因工程）•下游技术：含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移(载体)到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。1.2基因工程与生物工程、生物技术、遗传工程的关系•生物工程：直接或间接利用生物体的机能生产物质的技术。包括发酵技术、基因重组、细胞融合、细胞大量培养、生物反应器等技术。•生物技术：是在细胞水平上，特别是在分子水平上对生物体遗传性实现巨大的接近定向改造的一套内容繁多和复杂的技术。包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程。•遗传工程：人工改造生物体遗传性的技术。包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程等。基因工程的地位：高新技术生物技术基因工程基因克隆现代科技革命2.1基因工程诞生的理论基础1.DNA是遗传物质（基因工程的先导）1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。（1）肺炎双球菌转化实验2.基因工程的诞生与发展1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。2.DNA双螺旋结构（2）噬菌体转染实验1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNA。1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”DNARNAprotein1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等终于破译了64个遗传密码3.中心法则和遗传密码2.2基因工程诞生的技术突破1.限制性内切酶（restrictionenzymes）1970年H.O.Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。（标志着DNA重组时代的开始）WernerArber理论预见限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断HamiltonO.Smith得到第一个限制酶1978年Nobel生理或医学奖2.DNA连接酶（ligase）1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。3.载体（vector）1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。4.感受态体系1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。5.琼脂糖凝胶电泳1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。6.DNA测序技术1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术。1980年Nobel化学奖2.2基因工程的诞生•1972年，P.Berg领导的研究小组在世界上第一次成功实现了DNA体外重组；•1973年，Cohen等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落TcrNer，标志着基因工程的诞生。KanrandTetrTetracyclinepSC101EcoRIDNALigaseKanamycinR6-52.3基因工程的发展2.3.1基因工程的艰难阶段1975年西欧几个国家签署公约，限制基因重组的实验规模；1976年美国也制定了相应的法规。1976年已完成对DNA重组所涉及的载体和受体系统安全性改造，并建立了一套严格的DNA重组实验室设计与操作规范。2.3.2基因工程成熟阶段：1.1972-1976年，日本人，somatostatin；2.1977年，美国人，胰岛素基因；3.1978年，美国人，生长激素基因（HGH）；4.1978年，美国人，利用E.coli合成人胰岛素；5.1980年，美国/瑞士人，a干扰素－基因；6.1984年，日本人，白细胞介素2（IL-2）；2.3.3基因工程的腾飞：1.1982年，美国人，大鼠生长激素基因转入小鼠；2.1983年，美国人，Ti质粒导入植物细胞（细菌Neor基因）3.1990年，美国人，腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫缺陷症（SDID）4.1991年，美国倡导，人类基因组计划109bp，15年时间30亿USD；5.1997年，美国人，威尔英特克隆多利绵羊转移大鼠生长素基因的小鼠3基因工程研究的主要内容3.1基因工程研究的主要内容基础研究基础研究可克隆载体的研究受体系统的研究目的基因研究生物基因组学研究应用研究应用研究基困工程药物研究基因治疗研究转基因植物研究转基因动物研究1.分离DNA大分子选择合适的RE工具酶，分别对外源目的DNA分子和载体DNA分子进行酶解切割。3.2基本步骤：(分、切、接、转、增、筛、表）2.切割从复杂的生物基因组中，分离带有目的基因的DNA片断3.重组体的制备DNA连接酶将含有目的基因的DNA片断接到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。4.重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。6.克隆鉴定筛选和鉴定转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。7.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。5.目的扩增将带有重组体的细胞培养扩增，获得大量的带有目的基因的细胞繁殖群体。SS基因基因载体重组体分切接转筛表SS3.3基因工程的基本原理1、利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高宏观表达水平。这是涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学原理。2、筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件：启动子、增强子、上游调控序列、操作子、终止子。3、选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件，强化受体细胞中蛋白质的生物合成过程。4、基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生物效能的基础上，从工程菌大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反应器的增值速度和最终数量，也是提高外源基因表达产物的主要环节。分子遗传、分子生物学以及生化工程学是基因工程原理的三大基石。4基因工程的意义与发展前景4.1基因工程研究的意义基因工程可以绕过远缘有性杂交的困难，使基因在微生物、植物、动物之间交流，迅速并定向的获得人类需要的新的生物类型。概括地讲，其意义体现在以下三个方面：–大规模的生产生物分子–设计构建新物种–搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息。4.2基因工程发展前景•医药–重组药物–基因治疗–检测遗传疾病、病原•农业–抗病虫–提高品质–提高花卉的观赏价值–抗逆性–家畜•瘦肉比•饲料利用率•加快生长4.2.1基因工程在农业生产中的应用——第二次农业大革命1.提高植物的光合作用效率改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。（1）提高CO2的固定率改变光能交换系统的分子的基因结构。（2）提高光能吸收率和转化率使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。2.提高豆科植物的固氮效率是农业生物技术的主要内容。是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。3.转基因植物世界各国转基因作物大田释放情况（1987.1-1998.4）转基因作物特性批准项数所占比例抗除草剂129729.6%抗虫104623.8%产品质量高88620.2%抗病毒4369.9%农学性状好2114.8%抗真菌2084.7%其它3036.9%中国已经批准进入大田的转基因植物（1998.3）转基因植物特性申请单位获批准数马铃薯抗病毒中科院4抗病中国农科院1抗逆北京大学1高营养品质北京大学1水稻抗虫中科院1抗病毒北京大学2抗病农科院2抗除草剂水稻所1棉花抗虫中科院农科院美国孟山都公司9玉米抗虫美国孟山都公司等3大豆抗除草剂农科院1小麦抗除草剂北京农林科学院1高营养品质北京农林科学院1番茄抗病北京大学1耐储存中科院华中农大3甜椒抗病北京大学1辣椒抗病毒中科院1烟草抗病毒北京大学2抗虫中科院北京大学2番木瓜抗病毒中国热带作物1广藿香抗病农业科学学院1矮牵牛改变花色北京大学1杨树抗虫中科院1微生物提高固氮效率中科院农科院华中农大广东微生物所6将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。4.转基因动物在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物（TPA）和尿激酶的转基因小鼠；分泌a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等。4.2.2基因工程在工业中的应用——第四次工业大革命克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。1.纤维素的开发利用2.酿酒工业4.2.3基因工程在医药上的应用——第二次医学大革命1976年，27岁的风险投资人RobertSwanson与UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！Genentech的骄人业绩1976Genentech创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长激素素基因1980公司上市，募集$35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）1984第一个VIII因子，转让给CutterBiological1985第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（TPA）1990生产interferon11990与瑞士Roche医药公司合并（$2.1billion）制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、SARS）2.用微生物生产药物3.技术设计高效高特异性的生物制剂4.研制疫苗1.用转基因植物或动物生产药物大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等。应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）中文名称商品名称英文名缩写开发公司胰岛素HumulinNovolinHumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生长激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干扰素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFNrhuIFN1brhuIFN1brhuIFNa3ScheringRocheBiogenChironGenentechInterferonScience白细胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒细胞集落刺激因子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒细胞巨噬细胞集落刺激因子LeukinerhuGM-GSFImmunex红细胞生成素EpogenProcritrhuEPOAmgenOrtho组织溶纤原激活剂ActivaserhuTPAGenentech生长激素SerostinsomatotropinSerono促生长素Nutr