第2章 培养条件

第二章细胞培养的条件第一节细胞的营养离体细胞与体内的细胞在营养代谢上是有区别的。机体内的细胞营养可受神经和激素等进行一系列的统一调节，而离体的细胞则不受其调节。体外培养细胞的生长所需的基本营养物质，除碳水化合物、氨基酸和脂类三大类营养物质外，也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素等。一、水（1）水是一种良好的溶媒。营养物质只有溶于水吸收；代谢产物也需溶于水排泄。（2）水的比热高、潜热大调节温度（3）水中有溶解氧的存在供细胞呼吸（4）水有一定的表面张力，对生物形态的保存也有一定作用，细胞培养用水必须无毒、无害、含杂质少、纯度高。二、糖（1）葡萄糖是机体活动能量的主要来源。（2）维持渗透压三、氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位。（1）12种基本氨基酸：精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、胱氨酸及酪氨酸。（2）谷氨酰胺对细胞具有特殊作用:1、转氨基天门冬氨酸、天门冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸；2、可合成嘌呤、嘧啶利于细胞代谢；3、是合成ATP的必须物提供能源。（3）有时细胞培养还加以下7种氨基酸，即天门冬氨酸、天门冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸（非必须氨基酸）。半胱氨酸的主要作用是保护酶的活力，可消除培养液中的微量金属与细胞内酶结合后形成的抑制硫苷酸，利于细胞增生增寿、改善细胞外形。甘氨酸对细胞的大量生长有一定的促进作用（转氨基作用）。丝氨酸对肿瘤和成纤维细胞有促进生长的作用色氨酸的主要作用是可通过转氨基作用产生丙、甘、酪氨酸。四、维生素（1）酶的辅酶和辅基的组成部分，对细胞的代谢有重大的影响，某些维生素缺乏，短期可引起细胞死亡。如生物素、叶酸、胭酰胺、泛酸、吡多醇、核黄素、硫胺素及B12等。（2）维生素C也是不可少的，是氧化还原剂，具有递氢作用，利于细胞生物氧化还原作用，其他脂溶性维生素（A、D、E、K等）对细胞生长也有作用，它们常从血清中得到补充。补加白蛋白、谷胱甘肽、核酸和糖代谢中间物对细胞生长有益。五、无机离子和微量元素（1）钠：维持渗透压，可使细胞外质溶胶化粘度下降，细胞内粘度上升，增加组织细胞的应激性与增高细胞膜的渗透性，有利于细胞内外物质的转运。（2）钾：钾是激活细胞内某些酶所必需的。缺钾细胞变圆，胞质内颗粒增加，细胞界限不清楚，并产生一种特殊的树枝形细胞，24小时后细胞脱落死亡。（3）钙：钙对维持细胞膜的坚固和渗透性，对保持神经和肌肉组织的正常兴奋性有很大作用。许多酶必须有钙的存在才有活性。钙对细胞粘着性和贴壁能力也很重要。（4）镁：在细胞内镁是糖代谢某些酶系统的参加者。镁对细胞的贴壁也有重要作用，（5）磷：磷酸盐是细胞和细胞间液的组成成分，它参与一切基本物质如蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素的代谢，是能量ATP必不可缺的成分，可形成高能磷酸键以供细胞生命活动所需之能量。另外，它对维持组织内的酸碱平衡起着重要作用。（6）碳：重碳酸盐与CO2对细胞的生长和增殖很重要。它能使培养物产生最大糖分解以利细胞生长，可维持和调节培养基的pH。（7）微量元素：铁、锌、硒等微量元素对维持细胞的正常生理功能也同样起着重要作用。六、促生长因子体外培养细胞需要促进细胞生长的激素类物质，尤其是促细胞生长因子，如胰岛素能促使细胞利用葡萄糖和氨基酸，有促进有丝分裂作用，对很多细胞的增殖生长均有促进作用。氢化可的松对皮肤上皮细胞及乳腺上皮细胞增殖生长有很好的促进作用，还能提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率。实际应用中常利用动物血清来提供这些因子。有许多细胞因子对细胞定向分化有利，甚至有些细胞对其有依赖性(详情见表2-1）。第二节影响细胞生长的因素一、温度一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37~38℃，昆虫细胞25+1℃。高温：蛋白变性，酶失活，类脂质破坏室温：代谢下降，可短期保存（4℃~20℃）低温：在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡，但若向培养液中加入甘油或二甲亚砜等保护剂，可防止胞内冰晶的形成而刺破胞膜，可用于细胞种子长期冻存。冻存细胞时候常用慢冻速融法。℃二、渗透压细胞在高渗溶液或低渗溶液中，可以立即发生皱缩或肿胀、破裂。不同的细胞要不同的渗透压，可选用不同渗透压的培养基如表2-2。三、气体环境和pH氧：细胞呼吸，利于生物氧化，促进生长CO2：维持培养液的pH（细胞耐酸耐碱，增加CO2将使pH下降）。四、无毒和无菌五、辐射线和超声波（一）可见光：可见光的各种有色光能引起细胞退变，延长核分裂的间期，还可显著降低细胞的附壁能力。（二）紫外线：核分裂、有丝分裂受破坏。脱水收缩、起泡和细胞肿胀。（三）放射线：X、β、γ射线使核分裂数减少并出现不正常的核分裂。（四）超声波和振动：细胞紊乱，胶体结构变化，染色体畸变。六、细胞接种浓度(密度)培养液与细胞的容积比应小于2000:1，接种密度太低或太高都不利于细胞的生长增殖，如果接种密度太高，每个细胞周围培养液的容积降至0.007mm3以下，妨碍细胞的增殖。七、容器转动速度和悬浮搅动速度搅拌速度既不能太快，也不能太慢。太慢，细胞易结团、下沉和贴壁。太快，容易起泡沫，细胞易窒息致死，搅动易使细胞受机械损伤。BHK21的搅拌速度适宜为460~330r/min；淋巴细胞(Raji)株，在200r/min和400r/min；类淋巴细胞(Namalva)在80~100r/min。