叶绿素荧光及分析技术

叶绿素荧光与分析技术郑彩霞光合作用与叶绿素荧光在光合膜上，有2％到10%的吸收光能以PSII荧光的形式释放出来。而PSI发射的荧光量很小并且是恒定的，这里没有进行考虑。活体状态下，叶绿素荧光几乎全部来源于PSII的Chla（包括天线Chla），活体叶绿素荧光提供的快速信息仅仅反映了PSII对激发能的利用和耗散情况.光合作用过程的各个步骤密切偶联，因此任何一步的变化都会影响到PSII从而引起荧光变化，也就是说通过叶绿素荧光几乎可以探测所有光合作用过程的变化.JUNIORPAM（PulseAmplitudeModulatedFluorescence，PAM）基础调制叶绿素荧光仪JUNIORPAM的主要操作过程暗适应叶夹光适应叶夹•调制叶绿素荧光技术作为测定植物光合作用最简便有效的技术，在国际生物学界多个领域得到了非常广泛的应用，如研究植物胁迫、衰老、筛选突变体等。•PAM技术与荧光淬灭的饱和脉冲分析结合是目前测定植物光合作用的标准技术叶绿素荧光仪工作原理调制技术：用于激发荧光的测量光具有一定的调制（开/关）频率，检测器只记录与测量光同频的荧光，因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光，包括背景光很强时。饱和脉冲技术，打开一个持续时间很短（一般小于1s）的强光关闭所有的电子门（光合作用被暂时抑制），从而使叶绿素荧光达到最大。饱和脉冲（SaturationPulse,SP）可被看作是光化光的一个特例。光化光越强，PSII释放的电子越多，PQ处累积的电子越多，也就是说关闭态的电子门越多，F越高。当光化光达到使所有的电子门都关闭（不能进行光合作用）的强度时，就称之为饱和脉冲。SaturationPulseMethodofQuenchingAnalysisJUNIORPAM技术参数测量光源：蓝色LED，，标准强度0.1μmolm-2s-1PAR。光化光源：蓝色LED，光强范围0～1500μmolm-2s-1PAR（光纤与样品间的距离为1mm时）。饱和脉冲光源：蓝色LED，最大饱和闪光强度3000μmolm-2s-1PAR。远红光源：LED，730nm。微光纤：长40cm，直径1.5mm。测量参数：Fo、Fm、Fv/Fm、Ft、Fm’、Fo’、qP、qN、NPQ和rETR等暗适应中荧光的增加由暗适应和光适应下叶片光化学淬灭由最大到最小引起的（Fm-Fo和Fm’-Fo’）。光适应中荧光量的降低由不产生光化学淬灭和达到最大光化学淬灭（Fm-Fm’和Fo-Fo’）的光淬灭引起的。在饱和脉冲光发射之前，在Fm’和Fo’之间的区域内，诱导曲线上荧光的水平为F’，它表示PSⅡ反应中心的关闭程度。JUNIORPAM测量参数相对荧光产量（RelativeFluorescenceYields）暗适应下测定的参数Fm：关闭所有PSⅡ反应中心的高光强脉冲激发的最大荧光值。Fm=Fo+Fv。Fo：固定荧光或初始荧光产量，也称基础荧光。代表不参与PSⅡ光化学反应的光能辐射部分，是PSⅡ反应中心处于完全开放时的荧光产量，它与叶绿素浓度有关。Fv：可变荧光产量，代表可参与PSⅡ光化学反应的光能辐射部分，反映了PSⅡ原初电子受体QA的还原情况。Fo维持PSⅡ反应中心打开的低光强激发的最小荧光值。光适应下需要测定的参数Fo’：光处理中的最小荧光值：在Fo’-Mode中，Fo’荧光在饱和脉冲之后发出，暗适应是PSⅠ受到远红光激发快速转运光系统间的电子，因此开启PSⅡ反应中心。Fo’=1/(1/Fo-1/Fm+1/Fm’)Fm’：饱和光脉冲诱导期PSⅡ反应中心暂时关闭时的最大荧光值。F’：F’值是光处理期间打饱和脉冲光之前荧光曲线上的点的取值。JUNIORPAM测量参数continued荧光淬灭系数（FluorescenceQuenchingCoefficients）Fv/Fm和Y(Ⅱ)PSⅡ最大光化学消耗和有效光化学消耗Y(Ⅱ)衡量激发能用于光化学的量。qp和qL非光化学淬灭的参数这两个参数都是衡量PSⅡ反应中心那部分能量的。qp建立在单个的PSⅡ天线分子的概念上，而qL假设天线分子之间彼此联系，更接近于叶片内真实情况。这两个参数的测定不需要使用暗适应样品进行荧光测定，Fo按照Oxborough和Baker(1997)方法经过计算得到。qN和NPQ非光化学淬灭的参数这两个参数都与类囊体基质中依赖pH和玉米黄素产生过程的激发能的非光化学淬灭相关。与以前的荧光系数比较，qN和NPQ的计算总要测定样品暗适应和光适应条件下的荧光。Y(NO)和Y(NPQ)参与非光化学淬灭的能量对于集合光合天线分子，Y（NPQ）可以定量激发能通过光保护机制散失的能量：其他非光化学能量称为Y(NO)。最后，光化学和非光化学耗能之和为1：Y(Ⅱ)+Y(NPQ)+Y(NO)=1相对电子传递速率（RelativeElectronTransportRate,ETR）根据ETR=PAR•ETR-Factor•PPS2/PPPS•Y(Ⅱ)计算。光合激发辐射（Photosyntheticactiveradiation，PAR）为计算ETR，WinControl-3使用JUNIORPAM内部脉冲激发辐射装置得到PAR值。在其他光照条件下，不使用PAR带入ETR计算。光曲线(LightCurve)测量程序LightCurve指暴露在光强持续增加的活化光下的测定程序。通常，每个光强的时间间隔对于光合反应完全达到平衡太短。因此，将这中光曲线称为“快速光曲线”（RapidLightCurves，RLC），它说明当前光合的状态，不能和经典光合光相应曲线相混。JUNIORPAM测量参数continuedJUNIORPAM测量参数continuedThanks测量光源：蓝色LED，，标准强度0.1μmolm-2s-1PAR。光化光源：蓝色LED，光强范围0～1500μmolm-2s-1PAR（光纤与样品间的距离为1mm时）。饱和脉冲光源：蓝色LED，最大饱和闪光强度3000μmolm-2s-1PAR。远红光源：LED，730nm。信号检测：PIN-光电二极管，带短波截止滤光片（λ710nm）；选择性锁相放大器（专利设计）。微光纤：长40cm，直径1.5mm。测量参数：Fo、Fm、Fv/Fm、Ft、Fm’、Fo’、qP、qN、NPQ和rETR等主机大小：11.3x6.2x2.8cm重量：150g电源供应：由电脑供电耗电：基本操作200mW（5V/30mA），打开饱和脉冲时500mW（5V/100mA）工作温度：10～40℃工作湿度：35％～85％