甲壳动物蜕皮的调控

甲壳动物蜕皮的调控：综述与展望摘要：蜕皮是一个高度复杂的过程，它需要精确的协调才能完成。我们描述了早期经典的内分泌学实验来阐明激素和腺体在这一过程中所起的作用。然后，我们有描述了了一些近期实验，提供了一些关于蜕皮的细胞和分子调控方面的信息。除了提供这样一篇科学文献综述，也涉及了一些对未来研究的展望。关键词：20—羟基蜕皮酮；甲壳动物；节肢动物；蜕皮激素；蜕皮酮；蜕皮1.前言节肢动物要实现生长，必须快速脱掉角质层，摆脱其束缚，吸收水分或空气来生长、延伸新的、柔软的外骨骼，然后再迅速硬化外骨骼来保护自己和实现运动。节肢动物门中的甲壳纲和昆虫纲是研究蜕皮的内分泌调控很有价值的模式动物。在这篇综述中，我们主要来谈甲壳动物。2.经典的内分泌学实验蜕皮过程是一个周期性的事件，其高潮就是快速蜕皮，脱掉外骨骼（图1）。甾类激素的激素原—蜕皮激素，是从成百上千公斤的蛾蛹中分离出来的[1]。几年后，我们确定了蜕皮激素的结构，并且知道它来源于前胸腺。从随后的许多实验中发现，在大部分物种中，20—羟基蜕皮酮（20E）是蜕皮激素的生理活性形式。在甲壳动物蜕皮激素的类似研究中，我们观察到，甲壳动物最重要的蜕皮激素是20E[2]。经典的形态学观察和涉及器官切除[3]的内分泌实验显示，在普通滨蟹中,其蜕皮腺是胸部的Y器官（YO）。在蟹类中，YO是类似球状的腺体，位于内庭腹侧较前的位置。大甲壳亚目的YO较难定位，因为它是一层很薄的单层细胞。在J.DennisO’Connor的实验室，Chang(EC)开始用躄鱼属蟹和厚纹蟹的YO做器官培养试验。这些实验涉及了作为YO重要的分泌物—蜕皮激素的特性研究[4]。结果显示，蜕皮激素是20E的激素原。实验动物是EC晚上亲自在加利福尼亚PalosVerdes的岩石下捉的。这些YO实验涉及合适的器官培养试验方案的确定。确定成分的培养基，比如M199比简单盐溶液更能延长YO的分泌活动。然而，鉴定分泌产物需要收集和浓缩成百上千毫升的培养基，而简单盐溶液中的分泌产物含杂质少，因此用于质谱分析的激素在生理盐溶液中培养更易纯化。从小龙虾和三疣梭子蟹中也获得了相似的结果。更多的数据显示，在一些物种中，YO也分泌其它的蜕皮激素，包括3—脱氢蜕皮酮和25—脱氢蜕皮酮。未来研究的一个富有创造性的方面是不同甲壳动物的YO分泌的蜕皮激素的类型及其比例，不同的蜕皮激素，功能也可能不同，而这些方面现在还不太清楚。图1.小龙虾的蜕皮整个过程共30分钟，蜕皮是这个过程的高潮，由甾类激素20-羟基蜕皮酮调节。（A）小龙虾吸收了许多旧外骨骼的矿物质，并在胸部和腹部的连接处出现裂口。（B）动物的前部通过向后面拖来从外骨骼中缩回（C）虾的后部往前拔（D）虾摆脱了旧的外骨骼，开始吸收水分来延伸新的、柔软的外骨骼（E）蜕过皮的虾位于旧外骨骼的上方，它需要几天的时间使几丁质、蛋白质和碳酸钙沉积到外骨骼中。蜕皮周期将持续几天或几个月，根据动物的大小和年龄来决定。在蜕皮周期中，血淋巴中的蜕皮激素波动很大（龙虾蜕皮后期10pg/ul到前期350pg/ul）[5]，并且这些变化调节那些发生在蜕皮周期的生理、生化过程。在蜕皮周期中YO分泌或合成蜕皮激素的速率是不断变化着的，部分地解释了血淋巴中蜕皮激素滴度的波动。在蜕皮前期亚期之前，血淋巴中有高浓度的的蜕皮激素，而且发现移植的YO也分泌大量的蜕皮激素[6]。血淋巴中低浓度的蜕皮激素与它较低的分泌速率相关联。这就出现了一个问题:什么控制着YO的分泌速率呢？在一个世纪以前，移去蟹的两个眼柄造成一个蜕皮周期时间明显缩短。后来这在小龙虾和许多其他物种中被证实。通过这些观察，我们假定有一个内分泌因子存在于眼柄中，它正常地抑制蜕皮，即蜕皮抑制激素（MIH）[7]。详细的镜检发现了几种十足目甲壳纲动物眼柄中的神经血器官，被称为窦腺，主要储存神经内分泌物质。而构成窦腺的膨大末端的一群神经内分泌细胞被称为X器官(XO)[8]。我们在观察切除眼柄的十足目动物中发现，蜕皮周期缩短，很可能是因为循环蜕化类固醇的浓度迅速升高，这是由XO或窦腺的移去造成的。相反地，在切除眼柄的虾体内重新注入眼柄提取物，蜕皮激素的量降低，这个结果给MIH—YO蜕皮控制轴提供了额外的支持。Gerschetal为这个假设提供又一个证据。他证明：如果小龙虾在一开始就被注入了窦腺提取物，那接下来培养YO时，其产生的蜕皮激素的量就会减少。当虾的YO培养在条件培养基中，该培养基曾培养过移植的窦腺或加入过眼柄提取物时[10]，YO分泌蜕皮酮会被抑制。EC的实验室证明：当在螯虾体内注入窦腺提取物会减少蜕皮酮的循环滴度，延长蜕皮期。从普通滨蟹中提取的MIH是第一个被描述的MIH。EC的实验室就是从事H.americanus体内MIH的研究。当时，Keller正参观EC的实验室，他记住了普通滨蟹MIH的大部分序列，非常兴奋地看到这个序列的氨基酸与龙虾序列很相似。MIH是一个新颖的神经肽家族成员之一。这个家族的代表到目前为止仅仅在节肢动物中发现。这个神经肽家族调控多种功能，如蜕皮、生殖和代谢。MIH结合到YO细胞膜[11]的受体上，可能通过环核苷酸第二信使或通过改变钙离子流量和蛋白激酶C(PKC)的活性来调节它的活性，PKC在类固醇生成中使酶磷酸化[12]。MIH活性调控方式将在下面介绍。EC团队也研究了这个假设：即蜕皮酮可能反馈作用于XO、YO和其它靶组织来调节蜕皮。Chang和O’Connor证明：各种组织羟化蜕皮酮成为20E的活动会被外源的20E所抑制。Cheng和Chang证明通过注入外源20E，龙虾正常的蜕皮周期会被推迟。这些结果表明，要想完成正常的蜕皮周期过程，不仅需要提高蜕皮激素的浓度，还要在后来降低其量。蜕皮酮抑制机制尚不太清楚。ElHajetal.公布了一个发现：蜕皮酮受体位于眼柄的神经组织上。这些数据暗示，MIH的分泌可能存在一个正反馈或负反馈调控。最近，我们获得初步的数据：一个非甾族的蜕皮酮类似物（虫酰肼）能够抑制试管内蟹YO分泌蜕皮激素。这个结果是在浓度为50~100pg/ul的培养基中观察到的，不是在较低的浓度下观察到的。蜕皮酮抑制其自身的分泌可能解释了那个现象：即尽管眼柄组织没有再生，但是在去眼柄的龙虾体内，激素滴度仍呈周期性地升降[13]。3.蜕皮的分子调控3.1附肢因素有许多种信号影响YO的活动。外部因素，比如压力，极端温度，空间拥挤度，短光周期，都能抑制蜕皮[14]。对于陆地蟹，失去5个或多个步行足被称为多足自切（MLA）,能诱导蜕皮，因为肢芽（LBs）的生长局限于蜕皮前期。一旦开始蜕皮，肢芽开始延伸，并且变成多功能的附件。然而在蜕皮前期的早期，附肢自切（LBA）会延迟蜕皮2~3周，给出时间让附肢再度生长，这样虾蜕皮时会有完整的附肢[15]。通过这些研究，Skinner提出:肢芽能产生刺激和抑制因子，她分别把它们称之为肢自切的蜕皮间期因子（LAFan）和肢自切的蜕皮前期因子（LAFpro）。前者是第一个附肢自切引起的，它诱导产生蜕皮来应答MLA，LAFan的特性目前还不太清楚。后者是一个类似蜕皮抑制激素因子，由附肢的再生引起的，它通过降低血淋巴中蜕皮酮的浓度来抑制附肢的生长。到蜕皮前期的中期，虾开始要蜕皮，诸如附肢自切和蜕皮抑制激素的注入之类的干预不能延缓蜕皮前期，虾的蜕皮也不会推迟。地蟹是一种很好的实验动物来研究蜕皮的内分泌调控。它们遍及加勒比海，在沙滩上的沙丘上挖洞并生活在这些洞穴中。因为它们在实验室中易于饲养，且蜕皮也易于控制，DorothyBliss率先在19世纪50年代使用地蟹作为实验动物。1962年，Skinner发表了她的关于地蟹的第一篇论文，报告了在地蟹蜕皮周期中，其表皮结构的微观变化分析[16]，地蟹自此成为Skinner最初的实验动物，并长达40年。地蟹后来又成为Mykles的实验动物，当他在1979年进入Skinner的实验室，即橡树岭国家实验室，研究蜕皮诱导的螯虾肌肉萎缩（1966年发表）。当Mykles在1985年搬到美国科罗拉多州大学后，他继续研究地蟹。当Mykles在1998-1999年居住在BodegaMarine实验室时，他开始和Chang合作研究地蟹蜕皮的内分泌调控，即研究LAFpro[128]的特性。随后的工作直接转向YO神经肽信号通路的研究和肌肉萎缩的蜕化类固醇的研究[17]。由此，地蟹在60多年来已经成为研究甲壳动物蜕皮生理学的一种很重要的实验动物。3.2眼柄神经肽对YO的调控MIH和一种相关肽，即CHH，甲壳动物高血糖激素，抑制YO蜕皮酮的产生，它通过不同的信号通路，集中于环鸟苷酸（cGMP）。YO细胞膜上有CHH和MIH的特异受体。CHH受体是膜结合的鸟苷酰环化酶（GC）,然而MIH受体的特性还不确定。受体与CHH的结合直接导致cGMP含量的升高。与之相比，MIH信号经常涉及环腺苷酸（cAMP）含量的短暂升高，紧接着是cGMP含量大量持久地增高[18]。cGMP的延时增长暗示MIH活化一个可溶的GC，就像活化一个膜结合GC将导致cGMP的快速增长一样。cGMP和cAMP都抑制离体YO中蜕皮酮的产生。我们近期的工作揭示，对NO敏感的GC参与了反应，即GC-1竞争性抑制了YO蜕皮酮的产生。此外，YO表达了一种Ca2+/CaM依赖性的NO合酶（NOS）和GC-1的催化亚基。很多数据支持MIH信号通路由两部分组成，即cAMP/Ca2+依赖的“触发”阶段和一个NO/cGMP依赖的“总和”阶段，两阶段通过钙调蛋白（CaM）连接。cAMP的短暂升高引发Ca2流入细胞内，激活CaM（图2）。NOS的持续激活是由两个结果造成的，即Ca2+/CaM直接结合到NOS，通过CaN(Ca2+/CaM依赖性的磷酸酶)使NOS去磷酸化，从而活化NOS[19]。NOS的磷酸化降低了它的活性，而通过CaN的去磷酸化作用增强NOS的活性。NOS在活化的YO中是磷酸化的，在缺少MIH时，YO中NOS由于蛋白激酶的作用始终处于失活状态。这个类似于信号发送机制，通过十肽菌素刺激液体分泌物流到果蝇的马氏管中。MIH以脉冲的形式释放，每个脉冲的半衰期是5-10分钟，这造成在大部分处于蜕皮间期动物的血淋巴中MIH效价很低（5fmol/ml）。在这个例子中，持续活化GC-1提供一个机制：即在脉冲间抑制YO，这样就解释了处于蜕皮间期的动物，其MIH的平均效价很低时，YO是怎样被抑制的。3.3蜕皮周期中YO的变化YO是一个动态器官，在蜕皮周期中有4个生理状态的过渡（图3）。在蜕皮后期和间期，YO处于基本状态，血淋巴中的蜕皮酮效价很低。MIH的减少引发YO由基本状态到活化状态的转变，血淋巴中越来越多的蜕皮酮启动了表皮中（比如上表皮与外骨骼的分离）蜕皮前期的过程，以及蜕皮前期的早期肢再生。在蜕皮前期的中期，YO由活化态向committed状态转变，YO提高了蜕皮酮的生物合成，血淋巴中其浓度也达到一个峰值（300pg/ul）,爪肌肉萎缩，胃石也完全形成。高浓度的蜕皮酮引起YO由committed状态到抑制状态的转变。在蜕皮期，当蜕皮酮浓度很低时，YO又回到基态。YO在D0期活化是由窦腺中MIH的减少所引发的。它使YO去抑制，可能通过MIH信号组分的失活引起的，最终导致YO快速生长并提高蜕皮酮的生物合成能力（图3）。眼柄切除的动物，YO中的NOS是磷酸化的，表明在缺少MIH时，NOS是失活的，下游的目标大部分是不知道的，但是活化可能包括转录、翻译和翻译后调控。YO活化对数百个蛋白质表达产生重大影响。在转录水平，phantom(phm0，蜕皮酮生物合成途径中的一个关键酶，在蜕皮前期上调表达，它编码一个细胞色素P-450单加氧酶，能羟化蜕皮酮的前体（第25个C原子）。在虾中，YO中phm的表达在蜕皮前期增长了7倍，而通过注入窦腺提取物和MIH，则其表达降低了2.5倍。YO的活化也涉及了翻译调控。在躄鱼的YO中，翻译抑制剂放线菌酮抑制了蛋白质的合成和蜕皮酮的合成。与之相比，转录抑制剂放线菌素D抑制了RNA的合成，而对蜕皮酮的合成没有任何影响。MIH信号发送的