总RNA提取及其浓度、完整性测定

5.1.1.5.1总RNA提取及其浓度、完整性测定用Real-timeRT-PCR方法确定鸡各肠段NaPi-IIbmRNA表达量。用购自天根生化科技（北京）有限公司（TiangenBiotech(Beijing)Co.,Ltd.）的Trizol试剂提取十二指肠、空肠和回肠总RNA。用核酸蛋白检测仪在260nm波长处测定总RNA浓度。用琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性。总RNA提取步骤为：（1）预处理将肠粘膜样品从超低温冰箱取出（戴医用手套），迅速打开离心管盖子（否则会在液氮中取出时突然受热膨胀而爆炸），将开盖离心管放入纱布袋，纱布袋置于液氮罐中。（2）取样至超净工作台后，用液氮预冷研钵（研钵之前经酒精燃烧灭菌处理），并使研钵中留有液氮。用镊子夹出纱布袋中离心管，迅速置于研钵中，用研杵砸破离心管壁，镊子夹取肠粘膜样品（约50-100mg），迅速放入组织研磨器中（研磨器置于冰上）。（3）研磨先向玻璃研磨器中加入0.2mLTrizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mL离心管中；然后向玻璃研磨器内加入0.8mLTrizol溶液清洗，再全部倒入1.5mL离心管中。颠倒混匀10下，冰上静置5min。（4）分相向离心管中加0.2mL氯仿。盖紧样品管盖，用力摇晃试管15s，使其充分混匀，冰上静置5min。4℃条件下，12000g/min离心15min。（5）沉淀将上层水相转入新1.5mLEP管中（约400-500uL），加入0.5mL异丙醇，混匀后冰上放置15min，4℃12000g/min离心10min。此时离心管底部出现白色胶状沉淀，即RNA。（6）洗涤小心倒掉上清液，留取沉淀。加1mL75%预冷乙醇，用枪头把溶液沿离心管底部对胶状沉淀上下吹打几次。4℃条件下，7500g/min离心5min。（7）再溶解小心倒掉上清液，离心5s。用枪头将离心管内残留乙醇吸出。放置超净工作台，风机吹干约1-2min。加入20-50uLDEPC处理水，用枪头吹打几次，以便RNA快速溶解。（8）保存提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中。（9）完整性及浓度检测可从RNA样品中吸出3.0µL置于0.2mL离心管内用于RNA浓度测定（1.5-2.0µL/次），吸出2.0µL用于电泳检测RNA完整性。肉鸡肠粘膜RNA正常的浓度范围为1000-5000ng/µL。若电泳后出现3条带即28s、18s和5sRNA，则RNA完整性较好（一般可见前2条）。5.1.1.5.2RNA反转录用鼠白血病病毒MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）反转录酶合成cDNA第一链。MMLV反转录酶和RNA酶抑制剂购自宝生物工程（大连）有限公司（TakaraBiotechnology(Dalian)Co.,Ltd.），Oligo(dT)18引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司（ShanghaiSangonBiologicalEngineeringTechnology&ServicesCo.,Ltd）。反转录步骤为：（1）将以下试剂按顺序装入0.2mLPCR管（冰上操作）：DEPC处理水9.0µL总RNA（1500ng/µL）2.5µLOligo(dT)182.5µLdNTP（10mM）1.0µL[反应总体积15.0µL]（2）短暂离心（约5s），65℃温育5min，迅速置于冰中冷冻2min，短暂离心（约5s）。PCR仪顶盖温度104℃。（3）向0.2mLPCR管中依次加入以下试剂（冰上操作）：5×Buffer（Takara）4.0µLRNAaseInhibitor（Takara）0.7µLRTase（Takara）0.8µL[反应总体积20.5µL]（4）短暂离心（约5s），PCR仪上42℃温育60min，然后70℃温育15min，最后4℃保存。PCR仪顶盖温度设定为42℃。（5）反应完毕后，取出0.2mLPCR管，置于-20℃冰箱保存。以待PCR之用。5.1.1.5.3实时定量PCR根据GenBank已收录的鸡NaPi-IIb基因序列（NM_204474），利用PrimerPremier5.0软件设计NaPi-IIb基因引物为：上游，5’-GAAAGTGGTGAAGATGCC-3’；下游，5’-AAGTATGAGACCGATGGC-3’。扩增片段长度342bp。根据GenBank收录的鸡β-actin基因序列（NM_205518），利用PrimerPremier5.0软件设计内参β-actin引物为：上游，5’-CAGCCATCTTTCTTGGGTAT-3’；下游，5’-GTTTAGAAGCATTTGCGGTG-3’。内参基因片段长度344bp。