新城疫抗体测定技术

2013动物疫病检测新技术暑期培训国标ND抗体测定技术山东畜牧兽医职业学院朱明恩2013动物疫病检测新技术暑期培训国标：新城疫诊断技术（GB/T16525-2008）2009-05-01实施本技术依据中华人民共和国国家标准制定2013动物疫病检测新技术暑期培训是开设畜牧兽医类专业学校学生的必会技能是新城疫抗体监测和诊断的重要手段是2011和2012年全国农业技能大赛的比赛项目，据说还将是2014年全国农业技能大赛的比赛项目安排本内容的原因2013动物疫病检测新技术暑期培训新城疫抗体测定基本操作规程制备被检血清制备1%RBC悬液HA试验，测病毒的血凝价配制4单位病毒HI试验，测血清的抗体滴度抗体滴度报告，以nlog2形式报告2013动物疫病检测新技术暑期培训仪器及材料非免疫公鸡、pH7.2生理盐水、新城疫标准抗原、新城标准阳性血清、新城标准阴性血清、3.8%的枸橼酸钠、96孔V型板、微量移液器、吸头、微型振荡器、温箱、离心机、天平、采血器等。2013动物疫病检测新技术暑期培训心脏或静脉采血2-3mL（不加抗凝剂），采血后使血液在采血器或灭菌干净青霉素小瓶中凝固成斜面，室温下2-3小时或4℃冰箱中过夜使血清析出，也可通过离心加快血清析出。血清为淡黄色透明液体。一、制备被检血清2013动物疫病检测新技术暑期培训翅静脉采血针头在静脉血管一侧倾斜刺入皮肤，再与血管平行进针后刺入血管，见有少量回血即可采集血液，采血完成后马上用手压迫止血。2013动物疫病检测新技术暑期培训心脏采血鸡右侧卧保定，上腿自然踡曲，在上腿膝关节稍前下方约1cm处（心脏搏动最明显的部位）垂直地面进针采血。2013动物疫病检测新技术暑期培训二、制备1％RBC悬液1.制备抗凝血在采血器（注射器）中吸入抗凝剂（3.8%的枸橼酸钠，抗凝比例为1：10），心脏或静脉采血3-4mL，颠倒采血器使血液与抗凝剂充分混匀，然后将血液注入离心管中，用天平配平。2013动物疫病检测新技术暑期培训1．离心管、离心套管和管中液体作为一个整体进行配平2．离心管中液体不能太满配平注意事项2013动物疫病检测新技术暑期培训2.离心洗涤红细胞（1）共洗涤3次，转速和时间均为：2000r/min、5min。（2）第1次离心时间到，用移液器吸取并弃掉上清液、白细胞和血小板，加生理盐水，吹打混匀红细胞，配平后进行第2次离心，依此进行第3次离心。（3）第3次离心时间到，吸取并弃掉上清液、白细胞和血小板后，读出离心管中红细胞的体积。注意：吹打混匀红细胞时不要太用力，以免破坏红细胞。2013动物疫病检测新技术暑期培训2013动物疫病检测新技术暑期培训离心机的使用离心机放置平稳离心管对称放入离心机，使其处于平衡状态按档位依次升高转速至所需速度。离心时间到，将转速调为零，离心机停转后方可取出离心管。2013动物疫病检测新技术暑期培训3.配制1%RBC悬液根据红细胞的体积，计算所需生理盐水量，用所需生理盐水将红细胞泥全部冲入小烧杯中，摇匀即可。注意：摇匀时动作要轻柔，以防红细胞破碎或液体外溢。2013动物疫病检测新技术暑期培训红细胞凝集（HA现象）血凝性病毒有相应受体的红细胞RBC血凝素纤突受体血凝素纤突三、血凝试验（HA）1．基本原理2013动物疫病检测新技术暑期培训孔号123456789101112病毒稀释倍数生理盐水标准抗原生理盐水1%RBC悬液212223242526272829210211对照2525252525252525252525252525252525252525252525弃25252525252525252525252525252525252525252525252525振荡混匀，室温即20℃～25℃下静置40min后观察结果。若环境温度太高，放4℃静置60min。生理盐水对照孔红细胞成明显钮扣状沉到孔底时判定结果。2．操作术式（微量法，单位ul）新的操作方法和旧版有哪些不同？生理盐水、剂量、反应条件2013动物疫病检测新技术暑期培训HA试验结果及规律完全不凝集：红细胞呈明显钮扣状沉到孔底完全凝集：红细胞呈伞状均匀分布于孔底不完全凝集：介于两者之间2013动物疫病检测新技术暑期培训2013动物疫病检测新技术暑期培训病毒的HA价（血凝滴度）：能使红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍数称为病毒的血凝价，常用nlog2或1：xxx表示。HA试验成功的关键环节（HI同）正确使用微量移液器（吸头固定紧，每次都要排空）；吸头不能混用；悬滴加样；混匀要彻底；时间和温度合适。2013动物疫病检测新技术暑期培训四、4单位病毒的配制HA试验，测定做NDV病毒的血凝效价血凝效价除以4即为4V的稀释倍数用生理盐水稀释HA试验的NDV液4单位病毒液HA试验，测定做NDV病毒的血凝效价血凝效价除以4即为4V的稀释倍数用生理盐水稀释HA试验的NDV液HA试验，测定做NDV病毒的血凝效价血凝效价除以4即为4V的稀释倍数4单位病毒液用生理盐水稀释HA试验的NDV液HA试验，测定做NDV病毒的血凝效价血凝效价除以4即为4V的稀释倍数介绍：回归试验2013动物疫病检测新技术暑期培训回归试验用4V进行的HA试验（用4个孔），用于检验4V配制是否正确。4V配制正确的判定标准：前2个孔完全凝集，后2个孔不完全凝集，如下图：2013动物疫病检测新技术暑期培训五、血凝抑制试验（HI）当病毒与相应抗体结合后，病毒凝集红细胞的能力受到抑制，称为病毒的血凝抑制。Ag、Ab不对应RBC抗体红细胞凝集（HA现象）RBCRBCRBCRBCRBCRBCRBC血凝性病毒血凝素纤突RBC有其受体的红细胞血凝素纤突受体RBC血凝性病毒血凝素纤突vvvvAg、Ab对应HAHIRBCvvRBCRBC1．反应原理孔号123456789101112生理盐水被检血清血清稀释倍数4V25252525252525252525255025252525252525252525－－弃25212223242526272829210病毒盐水对照对照2525252525252525252525－轻叩反应板使反应物混合均匀，室温即20℃～25℃下静置不少于30min，4℃静置不少于60min。1%RBC悬液252525252525252525252525振荡混匀，室温即20℃～25℃下静置40min后观察结果。若环境温度太高，放4℃静置60min。生理盐水对照孔红细胞成明显钮扣状沉到孔底时判定结果。２．HI试验操作术式（微量法，单位ul）注意：除被检血清外，标准阳性和标准阴性血清各做一排。HI试验结果及规律完全不凝集：红细胞呈明显钮扣状沉到孔底完全凝集：红细胞呈伞状均匀分布于孔底不完全凝集：介于两者之间2013动物疫病检测新技术暑期培训血清的血凝抑制价：能使4V凝集红细胞的能力受到完全抑制的血清最大稀释倍数称该血清的血凝抑效价（HI价、抗体滴度、抗体效价）。请对左侧的结果进行抗体滴度报告2013动物疫病检测新技术暑期培训结果判定（新城疫抗体测定）在生理盐水对照孔出现正确结果（红细胞完全流下）的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，正确判读被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清的HI效价，以nLog2方式报告结果，并填写结果报告单。只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果方判定有效。HI滴度可以作为强毒感染和免疫监测验重要依据。当HI滴度≥9log2或HI滴度明显高低不齐，可怀疑为新城疫强毒感染。2013动物疫病检测新技术暑期培训细节决定成败2013动物疫病检测新技术暑期培训不当之处，敬请批评指正谢谢