布鲁氏菌

布鲁氏菌基础知识及本室研究现状布鲁氏菌病布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病是由布鲁氏菌属细菌引起的一类世界范围内流行的人畜共患传染病。严重危害着人类和多种动物的健康。布鲁氏菌可以引发人和牲畜及野生哺乳动物的感染，尤其牛、绵羊和山羊等家畜易染，给畜牧业带来巨大的经济损失。一布氏杆菌概述布鲁氏菌病又称地中海弛张热，马耳他热，波浪热或波状热，其临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大,被感染的人和动物表现为流产及不孕不育等症状1887年英国医生布鲁氏首先从死于“马尔他热”的英国士兵脾脏中分离出羊种布氏菌。布鲁氏菌属（Brucella)，包括6个种19个生物型：牛种布氏菌：1、2、3、4、5、6、7、9型羊种布氏菌：1、2、3型猪种布氏菌：1、2、3、4、5型鼠种布氏菌绵羊附睾种布氏菌犬种布氏菌1、形态布鲁氏菌是一组微小的球状、球杆状、短杆状细菌；宽约0.3—0.5微米、长0.6—1.5微米。电镜下见到的羊种菌为明显的球杆状、牛种菌和猪种菌为短杆状；6种布鲁氏菌靠形态很难区分，一般来说，羊种菌最小，牛种菌次之，猪种菌较大；布鲁氏菌没有鞭毛，不形成芽胞和夹膜。2、染色涂片染色检查多为单个排列，少见成对短链排列。布鲁氏菌可被碱性染料着色；革兰氏染色阴性；用0.5%沙黄水溶液染色，加热出现气泡，水洗后用0.5%孔雀绿或1%美兰复染，布鲁氏菌呈红色，其它细菌呈绿色和兰色。布鲁氏菌用柯氏染色染成红色3、培养特性1.布鲁氏菌培养营养要求高：需要各种氨基酸和各种金属离子，有的菌种需要血清才能生长。2.生长缓慢：一般需经4—6天，有的甚至21—30天才能长出菌落。3.生长所需温度：20—40℃，最适为37℃,超过42℃则不生长。4.C02:绵羊附睾种菌和牛种菌的某些生物型菌需严格的C02(5～10％)。4细菌变异布氏杆菌在各种理化因素作用下易发生变异;即从光滑型（S）变为非光滑型——粗糙(R)或粘液(M)状。变异菌落常比光滑型稍长，表面有颗粒。菌落颜色为灰白色或褐色，5抵抗力布氏杆菌在合适条件下能生存很长时间，有较高的抗灭活能力。对湿热、紫外线和各种射线以及常用的消毒剂、抗生素、化学药物比较敏感；对低温和干燥有较强的抵抗力，故可用冷冻真空干燥法保存菌种。二、从牲畜材料中分离布氏菌从牲畜流产胎儿检菌从胎衣检菌从阴道分泌物检菌尿液检菌乳汁检菌脓汁检菌血液培养脏器检菌布鲁氏菌常用分离用培养基血清葡萄糖琼脂培养基胰酶大豆培养基土豆琼脂培养基布病组阶段性成果1.布鲁氏菌强毒株与弱毒株基因组DNA差异基因筛选与鉴定应用代表性差异分析技术对流产布鲁氏菌强毒株544A和弱毒株104M进行基因组差减分析获得强毒株特有的9条差异片段和弱毒株特异的17条差异片段。经BLAST分析和PCR鉴定，最终证实3条差异片段，与流产布鲁氏菌经典弱毒株S19同源性在98%～99%之间，只在弱毒株104M基因组中检测出，而在强毒株544A中不存在。该实验为建立布鲁氏菌自然感染菌与疫苗株的基因鉴别诊断方法奠定了基础.2牛布鲁氏菌病噬菌体展示抗原的制备及其在诊断中的应用采用噬菌体随机12肽库模拟布鲁氏菌抗原表位，经健康牛血清反复多次预淘选之后，再以临床分离的布鲁氏菌阳性混合血清IgG为靶分子，进行了正常的3轮生物淘选，挑取单平板内所有50个噬菌体克隆，提取单链DNA并测序。运用间接ELISA方法、竞争抑制ELISA方法及Western-bloting方法分别鉴定测序得到的不同噬菌体克隆的亲和力、特异性及反应原性。最终得到两个亲和力高且特异性好的噬菌体克隆，命名为P2和P14。将特异性噬菌体P2和P14为检测抗原直接包被酶标板建立牛布鲁氏菌抗体检测的间接ELISA诊断方法，该方法特异性好，灵敏度高，与传统虎红平板凝集试验检测方法符合率为96.7%。采用胶体金免疫层析技术，使用胶体金标记G蛋白制备金标垫，以高特异性混合噬菌体克隆包被NC膜作为检测线，采用间接法原理组装了布鲁氏菌抗体快速检测胶体金试纸条，检测符合率分别为97.5%和97.8%。为布鲁氏菌病血清学诊断提供了一种特异性强、灵敏度高、简单快捷的检测方法。3.一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR方法该发明公开了一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR方法，涉及一种人畜共患传染病病原体的基因检测技术，适用于布鲁氏菌定性检测。本发明由标准阳性模板PCR反应液﹑布鲁氏菌BCSP31基因特异性引物、阴性指控标准品组成。本发明检测速度快、特异性好、灵敏度高,使用步骤简单，可重复性高，可以替代传统的病原学检测方法。现阶段任务1.布氏杆菌强、弱毒菌株感染小鼠巨噬细胞mRNA差异性分析，寻找新的抗布病关键性基因与作用机制研究。2.羊种布鲁氏菌强、弱毒菌株巨噬细胞中吞噬小体差异调控表达蛋白分析，寻找新的抗布病关键性基因与作用机制研究。3.患布病的羊与健康羊巨噬细胞miRNA差异性分析，寻找新的抗布病关键性基因与作用机制研究。4.将布鲁氏菌外膜蛋白OMP10基因敲除的新型标记疫苗的研制，使布鲁氏菌自然感染和疫苗接种有效的区分。