中药分析学(第2章)剖析

11第二章中药杂质及有害物质分析22主要内容1.中药杂质及有害物质检查的一般要求2.中药杂质及常规检查方法3.重金属及有害残留物分析4.内源性有害物质分析5.黄曲霉毒素及微生物学检查33本章学习要求要求344杂质杂质：无治疗作用，影响药物疗效和稳定性，甚至对人体健康有害。杂质检查：保证药物的安全、有效、均一和纯度杂质来源：主要来源于药物的加工、生产和贮藏三个环节。有害物质内源性有害物质：中药本身含具有毒副作用的化学成分，如马兜铃酸、乌头碱、吡咯里西啶类生物碱。外源性有害物质：残留农药、有机溶剂、大孔树脂，重金属及有害元素，微生物和黄曲霉毒素等。第一节中药杂质及有害物质检查的一般要求55限量检查杂质限量不影响疗效和不发生毒性的前提下，药物中可能存在的杂质，允许还有一定量，最大允许量为杂质限量。药物中杂质的检查一般只检查是否超过限量，这种方法称杂质的限量检查。通常用百分之几（%）或百万分之几（ppm）或mg/kg来表示。杂质限量=杂质限量杂质最大允许量样品量杂质及有害物质的限量检查66检查方法对照法灵敏度法含量测定法比较法最大限度量待检杂质或待检物对照品（或标准品）溶液，与供试品溶液，在相同条件下实验，比较结果，以确定是否超过限量。在供试品溶液中加入试剂，在一定条件下反应，观察有无阳性结果出现，以判断杂质是否超限。取供试品一定量，依法检查，测定待测品的某些特征参数，与规定的限量比较，以判断是否超限。用规定的方法测定杂质的含量，与规定的限量比较，以判断杂质是否超限。限量检查方法771.杂质检查2.干燥失重（详见药典）3.水分测定4.灰分测定5.色度检查（详见药典）6.酸败度测定（详见药典）第二节中药杂质及常规检查方法88筛选称重YourtextYourtext取规定量样品，摊开，用肉眼或放大镜（5-10倍）观察，将杂质检出。将各类杂质分别称重，计算其在供试品中的含量（%），如丁香中杂质不得过2%，女贞子中杂质不得过3%1.外观难以鉴别时，可进行显微或理化鉴别试验，证明其为杂质后，计入杂质重量中。2.杂质检查所用的供试品量，除另有规定外，按药材和饮片取样法称取。3.需采用特殊方法进行检查的杂质，应给出具体方法。注意事项一、药材中混存杂质检查法991234烘干法二、水分测定法甲苯法减压干燥法气相色谱法甲苯法水分测定装置适用于含挥发性成分的药品，不适用于微量水分的测定。因200ml甲苯可吸水0.1ml，故需预处理。甲苯先加少量水，充分振摇后放置，将水层弃去，甲苯经蒸馏后使用。1010总灰分：中药经粉碎后加热，高温炽灼至灰化所遗留的无机物。酸不溶性灰分：中药经高温炽灼得到的总灰分加盐酸处理，得到不溶于盐酸的灰分。三、灰分测定及炽灼残渣检查11111总灰分测定法取适量供试品于炽灼至恒重的坩埚中，称定重量，缓缓炽热，避免燃烧，至完全炭化时，逐渐升高温度至500℃-600℃，使完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算总灰分的含量（%）。2酸不溶性灰分测定法取总灰分，先用稀盐酸加热溶解，无灰滤纸滤过，再洗涤至洗液不显氯化物反应为止。干燥，炽灼至恒重，计算酸不溶性灰分的含量（%）。3注意事项供试品需适量粉碎，使其能通过2号筛，将粉末混合均匀后再取样。如供试品不易灰化，可将坩锅放冷，加热水或10％硝酸铵溶液2ml，使残渣湿润，然后置水浴上蒸干，得到的残渣再按前法炽灼至坩锅内。(一)灰分测定法1212取供试品适量，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温；除另有规定外，加硫酸0.5~1ml使润湿，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在700℃~800℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在700℃~800℃炽热至恒重，即可。如需将残渣留作重金属检查，则炽热温度必须控制在500℃~600℃。(二)炽灼残渣检查法中药经炽灼炭化，再加硫酸湿润，加热使硫酸蒸气除尽后，于高温炽灼至完全灰化，使有机物破坏分解变为挥发性物质逸出，残留的非挥发性无机杂质（多为金属的氧化物或无机盐类）成为硫酸盐，称为炽灼残渣。1313重金属及有害元素重金属及有害元素包括铅（Pb)、镉（Cd)、砷（As）、汞（Hg）、铜（Cu）等。其毒性作用主要是由于与体内酶蛋白上的-SH和-S-S-键牢固结合，从而使蛋白质变性，酶失去活性，组织细胞出现结构和功能上的损害。检测方法1.重金属总量用硫代乙酰胺或硫化钠显色反应比色法测定。2.砷盐的检测用古蔡法或二乙基二硫代氨基甲酸银法3.单个铅（Pb)、镉（Cd)、砷（As）、汞（Hg）、铜（Cu）元素的测定使用原子吸收光谱法和电感耦合等离子体质谱法进行测定。第三节重金属及有害残留物分析1414一、重金属及砷盐总量检查法pH3.5CH3CSNH2＋H2OCH3CONH2＋H2S↑Pb2＋＋H2S→PbS↓（黑色）＋2H＋原理方法第一法——硫代乙酰胺法取纳氏比色管两支，甲、乙两管中按照规定分别制成对照品、供试品溶液；同置白纸上，自上向下透视，乙管中显出的颜色与甲管比较，不得更深。15151供试品如有色应在加硫代乙酰胺试液以前在对照溶液管中滴加少量稀焦糖液，使之与供试品溶液管的颜色一致，然后再加硫代乙酰胺试液比色。如仍不能使两管颜色一致时，可取两倍量供试品加水溶解后，分成两等份，在一份中加入硫代乙酰胺试液，经滤膜滤过（除去金属硫化物沉淀），加入规定量的标准铅溶液作为对照溶液，再与另一份供试溶液按规定方法处理后比较。2供试品如含高铁盐影响重金属检查时，可先加抗坏血酸0.5-1.0g，并在对照液中加入相同量的抗坏血酸，再照上述方法检查。3供试品为铁盐可在相对密度1.103-1.105的盐酸（盐酸9ml加水6ml）中，使大部分Fe3+生成HFeCl62－（六氯合铁离子）,用乙醚提取除去；再加氨试液使溶液呈碱性，用氰化钾掩蔽残留的微量铁盐后，加硫化钠试液检查铅盐。4药物本身也能生成不溶性硫化物干扰重金属的检查时，应作特殊处理。供试品的处理1616将供试品炽灼破坏后，加硝酸加热处理，使有机物分解破坏完全后，再按一法进行检查。原理方法取炽灼残渣项下遗留的残渣，按照规定分别制成对照品、供试品溶液；照一法检查，即得。第二法——炽灼后硫代乙酰胺法1717炽灼温度对重金属检查影响较大，温度越高，重金属损失越大，应控制在500℃~600℃炽灼使完全炭化。炽灼残渣加硝酸加热处理后，必须蒸干除尽氧化氮，否则亚硝酸可氧化硫化氢析出硫，影响比色。如使用盐酸超过1ml（或与盐酸1ml相当的稀盐酸），或氨试液超过2ml，以及用硫酸与硝酸进行有机破坏或其他试剂处理者，除另有规定外，对照品溶液应取同样量试剂在磁皿中蒸干。含钠盐或有氟的有机药物在炽灼时能腐蚀瓷坩锅而引入重金属，应改用铂坩锅或硬质玻璃蒸发皿。注意事项1818二、农药残留量测定方法农药分类(从化学成分角度)杀虫剂可分成有机氯化合物、有机磷化合物、氨基甲酸酯、有机氮化合物、拟除虫菊酯、有机氟化合物、有机锡化合物、特异性杀虫剂等。杀菌剂又可分成有机氯杀菌剂、有机磷杀菌剂、有机硫杀菌剂、有机汞杀菌剂、无机杀菌剂、抗菌素等。1919农药危害1.有机氯类农药：易在脂肪中蓄积，造成慢性中毒。2.有机磷类农药：抑制生物体内胆碱脂酶的酶活性，从而引发中毒。3.氨基甲酸酯类农药：使胆碱酯酶丧失对乙酰胆碱的水解能力，造成一系列中毒症状。4.拟除虫菊酯类农药：影响细胞色素C和电子传递系统，可直接作用于神经末梢和肾上腺髓质。农药的污染途径1.环境对药材的污染2.中药栽培中农药的污染3.采收、加工、贮存、运输过程中的污染。2020常用的方法有漂洗法、振荡法、组织捣碎法、冷浸法、索氏提取法、超声法、固相萃取法、超临界萃取法等。提取溶剂的选择考虑提取溶剂的纯度、极性提取检测常用气相色谱法对残留农药进行定性和定量。测定有机氯农药时，使用电子捕获检测器（ECD）测定有机磷农药时，使用火焰光度检测器（FPD）中药中残留农药的提取和纯化2121毛细管柱顶空进样程序升温法第二法有机溶剂残留量的检查常采用气相色谱法，现行中国药典收载有3种方法。第一法第三法毛细管柱顶空进样等温法溶液直接进样法三、有机溶剂残留物测定法2222一类不带离子交换基团的多孔交联聚合物,可通过物理吸附从溶液中选择性吸附有机物质，在中药的分离纯化中被广泛应用。其制备过程中使用了苯乙烯和二乙烯苯等作为原料,并加入了一定比例的致孔剂,残留物有正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯和二乙烯苯气相色谱法，采用聚乙二醇为固定相的弹性石英毛细管柱，氢火焰离子化检测器，外标法。四、大孔树脂残留物测定法2323黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素B2黄曲霉毒素M1黄曲霉毒素M2黄曲霉毒素G1黄曲霉毒素G2OOOOOOCH3OHOOOOOOOCH3OOOOOOOCH323第四节、黄曲霉毒素及微生物学检查一、黄曲霉毒素测定黄曲霉毒素（aflatoxin）是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，是一类结构相似的化合物，基本结构都有二呋喃和香豆素（氧杂萘邻酮），有较强毒性。2424第四节、黄曲霉毒素及微生物学检查黄曲霉素性质耐热，在280℃时可发生裂解。低浓度毒素B1易受紫外线破坏。遇氧化性物质、氢氧化钠和氨水等均可被破坏。在水中溶解度很低，易溶于油及一些有机溶剂，如氯仿、丙酮、甲醇等，但不溶于乙醚、石油醚和己烷中。2525黄曲霉毒素的测定方法1.微柱法本法做中成药中黄曲霉毒素筛选用，不能分辨黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等。测得结果为黄曲霉毒素的总量。将样品提取液通过氧化铝-硅镁型吸附剂填充的微柱，样品中的杂质被氧化铝吸附，黄曲霉毒素则被硅镁型吸附剂吸附。在紫外光灯下观察荧光环与标准比较定量。2626黄曲霉毒素的测定方法样品中的黄曲霉毒素B1经提取、浓缩和用单向展开法在薄层上分离后，在365nm紫外光灯下产生蓝紫色荧光。根据在薄层上显示荧光的最低检出量定量。单向展开2.薄层色谱法单向展开后，若黄曲霉毒素B1含量低，无法观察到荧光时，需改用双向展开法。先用无水乙醚对薄层做横向展开，再用氯仿-丙酮（98：2）混合液做纵向展开。双向展开2727黄曲霉毒素的测定方法3.高效液相色谱法原理黄曲霉毒素都具有紫外吸收，但荧光较弱，常通过衍生使荧光增强。可用柱前三氟乙酸衍生、柱后碘衍生和柱后过溴化溴化吡啶（PBPB）衍生，用荧光监测器进行检测。方法1.配制黄曲霉B1、B2、G1、G2的混标溶液及黄曲霉素衍生标样2.样品提取及净化：样品粉末先后用石油醚（或正己烷）、甲醇-水提取、氯仿萃取后，加无水硫酸钠、弗罗里硅土除杂，收集氯仿-己烷、氯仿-甲醇、丙酮-水的淋洗液，回收溶剂至干。3.制备衍生物：加衍生试剂后，水浴反应4.测定：流动相为甲醇-0.01mol/LKH2PO4，荧光检测器，激发波长360nm，发射波长425nm。2828中药的微生物学检查微生物限度检查法是检查非规定制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法，检查包括细菌素、霉菌素、酵母菌素及控制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度10000级以下，局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检查过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。2929本章重点小结