拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

1拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：我们用CTAB法提取拟南芥的T-DNA插入突变体的DNA，然后用三引物法进行PCR和琼脂糖凝胶电泳来判断其为突变纯合体还是突变杂合体。通过这次实验，我们掌握了如何来判断纯和突变和杂合突变。关键字：拟南芥T-DNA插入突变突变体的鉴定前言：拟南芥拟南芥是十字花科的植物，它是植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物，其具有以下这些特点：①植株形态个体小，高度只有30cm左右；②生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；③种子多，每株可产生数千粒种子；④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；⑤遗传转化简单，转化效率高；⑥基因组小，只有5对染色体，125MB；⑦在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。突变体突变体在植物基因分离及遗传学研究的最重要材料，通过自然突变或者人工诱变同源重组、基因沉默以及插入突变等方法都可以用来构建突变体，人工诱变是指利用物理因素（X射线，Y射线，紫外线，激光等）或化学诱变(如亚硝酸，硫酸二乙酯）来处理生物，使生物发生基因突变，这种方法可提高突变率，创造人类需要的变异类型。目前，人工诱变拟南芥常用的方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签等。T-DNA插入突变Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。人们根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。T—DNA插入突变最大的用处是构建突变体库，在此基础上构建侧翼序列库；目前在拟南芥中已经建立了接近饱和的T—DNA插入突变体库，该突变体库包含超过225000个独立的T—DNA插入株系，在预测的29454个基因中有21700个基因发生了插入突变[6]。含T～DNA激活标签的拟南芥群体已经获得，并且在这些群体中已经获得大量的异常突变体和被标记基因。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转2移与整合，获得转基因植株。除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体；而且T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。质粒pROK2T-DNA插入突变体PCR鉴定的原理农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。“三引物法”的原理如图1所示，即采用三引物(LP、RP、LB)进行PCR扩增。3本次试验所用的引物LP:5’-TCATCCACCATGGAAGAAAAGRP:5’-TTGGATACGATGCGAGTAAACBP:5’-TTGTTCACGTAGTGGGCCATCGCTAB法提取DNA的原理CTAB的主要作用是破膜。CTAB属阳离子表面活性剂，能溶解膜蛋白与脂类，也可解聚核蛋白。在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA。材料与方法1.植物材料和试剂材料：42号拟南芥试剂：液氮、CTAB提取液、氯仿/异戊醇、异丙醇、70％乙醇、TE缓冲液、PCR反应Buffer、ddH2O、MgCl2、三种引物、Taq酶、琼脂糖、TAE缓冲液、EB染液器材：Ep管、离心机、移液器、枪尖、PCR小管、电泳仪、凝胶成像仪2.单株总DNA的提取（CTAB法）1）先把CTAB提取液放至65℃水浴锅中，加热CTAB提取液至65℃。2)取拟南芥的植株一颗，去除根部后将叶片放入Ep管中，加入一定量的液氮，当液氮快要挥发完的时候用事先也用液氮冷却的研磨棒将植株研磨成粉末;3)加入65℃预热的600µlCTAB提取液并混匀;4)将Ep管放入65℃水浴锅中水浴45min，间隔一会慢慢摇匀一次;5)取出Ep管，12,000rpm离心10min;6)将上清转移到新离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀;7)12,000rpm离心10min,将上清液转移到新管中；48)向上清中加入等体积异丙醇,放在冰箱中静置10min;9)12,000rpm离心10min；10）弃上清，加入500µl70％乙醇，12,000rpm离心5min；11）弃上清，加入500µl70％乙醇，12,000rpm离心5min12)弃上清，12,000rpm空离5min，13）弃上清，吸干残留液体放置在风口处干燥，使其中残留的乙醇挥发14)加25µlTE缓冲液溶解DNA15）将提取的DNA放入4℃冰箱中保存3.PCR鉴定以所提取的植株总DNA为模板，进行PCR扩增。1）取两个PCR小管，其中一管按下表依次加入ddH2O、10×Buffer、dNTP、MgCl2、引物RP、LP、Taq酶、上周提取的DNA，另一管也按照下表加入ddH2O、10×Buffer、dNTP、MgCl2、引物RP、BP、Taq酶、上周提取的DNA表一：PCR反应体系（20ul）ddH2O12.4ul10×Buffer2.0uldNTP0.5ulMgCl22.0ul引物RP0.5ul引物LP/BP0.5ulTaq酶0.1ul上周提取的DNA2.0ul总体积20.0ul2）将PCR小管放入PCR仪中，进行PCR扩增，其循环参数为：94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃1min20s，33次循环，72℃7min3）PCR结束以后，将样品拿出，检查管子上的株号是否清晰，放-20℃保存，等待下周琼脂糖凝胶电泳检查结果。4.琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果1）配制缓冲液：将50×TAE稀释至1×TAE缓冲液2）制胶：称取0.6g琼脂糖于300ml三角烧瓶中，加50ml1×TAE制成1.2%琼脂糖凝胶。微波炉加热至琼脂糖完全溶化，待冷却至60℃左右，缓慢倒入架有梳子的电泳胶板中，勿产生气泡，静置冷5却30min以上。待其完全凝固，垂直向上拔出梳子，将胶连同托盘一起放入电泳槽中央，加入缓冲液，液面应高于胶面1-2mm，准备上样。3）上样：取PCR产物加3-4μl6×loadingbuffer混匀，在加样孔上方1-2mm处垂直点样，同时将上周提取的DNA加入适量的6×loadingbuffer，混匀，点样，marker为DL2000，4）电泳（120V稳压电泳，电泳时间根据电泳条带的迁移情况判断）。5）染色及观察：电泳完成后，将胶放入EB染液中染色约10min，水洗，在凝胶成像仪中观察电泳结果，摄片，剪辑，保存，分析结果。结果三引物法PCR鉴定的结果图二：PCR产物凝胶电泳图（泳道1为DL2000，泳道8为CTAB法提取的40号拟南芥的DNA，泳道9为引物LP和RP扩增的PCR产物，泳道10为引物BP和RP扩增的PCR产物）分析：如果拟南芥为纯合突变体植株，则因为目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA本身的长度约为17kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以只能得到1种以LB与RP（或LP，根据T-DNA在基因上插入的方向选择）为引物进行扩增的产物，分子量约410+Nbp，即从LP或RP到T-DNA插入位点的片段，长度为300+Nbp，再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp。而根据老师给的资料，我们使用的具有特定插入基因的拟南芥，若是突变纯和体的话，应该产生小带，大小在560-860bp之间；如果拟南芥为野生型植株，因为目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，产生大带，分子量约1107bp，即从LP6到RP。如果拟南芥为杂合突变体植株，因为只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+Nbp和900bp大小的两种产物。我选的拟南芥为42号拟南芥，泳道8为基因组DNA的电泳检测结果，可是本来至少应该有一条比较大的条带（理论上基因组DNA的电泳检测结果应如下图三所示），可是我的基因组DNA没有条带，猜测是因为点样时所加的量太少导致的。泳道9中引物LP和RP扩增的PCR产物只有一条100bp左右的非特异性条带，产生这条100bp左右的条带的原因可能是PCR反应体系的引物浓度过高，或者是某条引物与反应过程中某个阶段的PCR产物结合，形成非特异扩增所致。泳道10为引物BP和RP扩增的PCR产物有一条750bp左右的条带和一条100bp左右的非特异性条带，因为用引物LP和RP没有扩增出目的条带，引物BP和RP扩增出的目的条带只有一条为750bp左右的条带，所以该突变体拟南芥为突变纯合体。图三：理论基因组DNA电泳结果图四：野生型、突变杂合体、突变纯合体的鉴别讨论1.实验中应注意：1）研磨后应迅速加入提取液，因为提取液中含EDTA，能够螯合Mg2+等二价阳离子，防止破碎细胞中的DNA酶降解DNA。2）DNA在化学上是稳定的，但它在物理上是易碎的，高分子质量的DNA长而弯曲，即具有极微弱的侧向稳定性，易受到最柔和的流体剪切力的伤害，由吸液、振荡、搅拌所致的水流能剪切断DNA双链，所以在提取过程中，避免剧烈震荡，以免对DNA造成不必要的机械损伤。3）干燥DNA时，尽量使乙醇挥发干净。4）融胶时应注意不能沸出，冷却至约60℃制胶，凝胶充分冷却凝固后点样进行电泳。75）EB是一种荧光染料，它对人体可能有一些诱变作用，染色时一定做好防护。2.溶剂的作用酚/氯仿/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质，并有利于水相与有机相的分开，而且可以消除泡沫。异丙醇或乙醇的作用是脱去DNA周围水分子，使DNA失水而聚合沉淀。3.T-DNA插入突变构建植物突变体库的缺点T-DNA的整合是一个复杂的过程,易产生直接的串联,反向重复和边界缺失,这将会影响到随后的分子分析。其次,T-DNA方法具有很大的宿主范围限制,仅对那些可快速有效进行农杆菌转化的生物体非常有效。4.对T-DNA插入突变体进行鉴定的另一种办法—“双引物法”“双引物法”的基本原理与“三引物法”相似，即采用特异引物扩增目的基因片段和T-DNA插入片段，通过比对扩增结果进行突变体的鉴定。具体方法如下图所示：首先以基因组DNA作为模板，用一对特异引物(LP和RP)扩增目的基因片段，初步鉴定出纯合突变体，然后再以基因组DNA为模板，由T-DNA片段的特异引物(LB)与LP或RP组成一对引物，扩增目的基因T-DNA插入片段，以确证所获突变体为T-DNA插入目的基因的突变体此法的不足之处是完成最终鉴定需进行两轮PCR扩增。5.“三引物法”与“双引物法”的比较“三引物法”操作比较简单，但在实际操作中由于PCR反应体系的引物浓度过高，或者是某条引物与反应过程中某个阶段的PCR产物结合，形成非特异扩增等原因，还无法获得理想的PCR扩增结果而导致鉴定失败。而“双引物法”可避免上述现象产生，鉴定成功率高，结果可靠，但它的不足之处是完成最终鉴定需进行两轮P