细胞生物学实验

1实验室规则和要求一般规定1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“安全”是进行任何实验最重要的事项。2.在实验室内请穿著实验衣（最好长及膝盖下），避免穿著凉鞋、拖鞋（脚趾不要裸露）。留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。3.在实验室内禁止吸烟、吃东西、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外套及杂物等。4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。每组分配之仪器、耗材请在课程开始前确定清点与保管，课程结束后如数清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用。实验前后，请把工作区域清理擦拭，并随时保持环境清洁。5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，适切记下自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。6.身体不适、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验室。7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验室前记得洗手。8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变措施。2药品1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、注意事项，翻阅物质安全资料，查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、注意事项及配制日期，为避免污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、-巯基乙醇、甲醛、酚等）要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺（神经毒）、溴化乙啶（突变剂）、SDS（粉尘）请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好习惯。5.使用后的实验试剂和材料，应放在专用的收集桶内。固体培养基、琼脂糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。6.使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或吸耳球。仪器1.使用仪器前先了解其性能、配备及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸，勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。2.使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，离心机未停下不得打开盖子。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。3.电源供应器有高电压，切勿触摸电极或电泳槽内溶液，手湿切勿开启电源。34.使用微波炉加热，不可有铝箔等金属物品，瓶盖必须松开，以免爆炸。加热后戴防热手套取出瓶子，务必轻摇晃，确认不会突沸。水浴锅、干燥器等，使用前熟悉操作手续，严防烫伤。5.操作台上有酒精等有机溶剂及易燃物（如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等）要远离火苗，不可留置火焰燃烧，万一着火，应力持镇定，沉着处理。酒精或乙醚等着火时，应使用泡沫灭火剂或湿毛巾覆盖，勿使用水冲泼。6.实验完毕后需清理实验台，除需收回共用物品外，不留任何器皿。倾倒的试剂、水渍应擦干净，保证实验台和实验前同样清洁。7.值日组协助实验室管理人员收回共用物品，清洁仪器，清理实验台，打扫实验室。4第一部分基础实验实验1显微技术概述实验目的：使学生了解基本的细胞生物学实验操作，熟悉常规和常用的实验方法。锻炼学生动手能力，增强学生基本科研技能和科研思路；了解目前常用细胞生物学研究方法。任务：细胞生物学作为高校生命科学的主干课程之一，从本质上讲是一门实验科学，因此设置实验课程十分重要，学生可以通过这一教学环节掌握细胞生物学的基本研究手段和方法，并更深入理解理论课的各方面内容。进一步讲，细胞是生物构成的基本单位，是理解一切生命现象的基础，许多细胞生物学实验方法也用于遗传学，分子生物学，生物化学等科学实验研究，在将来的各项工作中将会有广泛的实际用途。培养目标：使学生掌握细胞生物学实验技术，提高学生分析问题和解决问题的能力，为了今后独立进行科研工作打下坚实的基础。实验2细胞膜的渗透性一、实验目的了解细胞膜的渗透性质及各种物质跨膜进入细胞的不同速度二、实验原理将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的渗透性不同，有的溶质可以渗入，有的溶质则不能渗入；渗入的溶质能够提高红细胞膜的渗透压，5所以水分进入细胞引起溶血。由于溶质渗入速度不同，因此溶血的时间也不相同。三、实验器材与试剂器材：50ml小烧杯，10ml移液管，试管（1～10ml），试管架。试剂：0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化铵，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/L草酸铵，0.12mol/L硫酸钠，0.32mol/L葡萄糖，0.32mol/L甘油，0.32mol/L乙醇，0.32mol/L丙酮。实验材料：动物血液（如羊血）四、实验步骤1、羊血细胞悬浮液取50ml小烧杯一只，加一份羊血和10份0.17mol/L氯化钠溶液，形成一种不透明的红色溶液，即稀释的羊血。2、低渗溶液取试管一只，加入5ml蒸馏水，再加0.5ml稀释的羊血，注意观察溶液颜色变化，由不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成溶血，全部红细胞溶血后光线比较容易透过溶液。3、羊红细胞渗透性（1）取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠溶液5ml，再加入0.5ml稀释的羊血，轻轻摇动，观察颜色变化及溶血现象，说明原因。（2）取试管一支，加入0.17mol/L氯化铵溶液5ml，再加入0.5ml稀释的羊血，轻轻摇动，观察颜色变化及溶血现象，说明原因。（3）另外8种等渗溶液进行同上实验记录实验结果并简单分析表1不同低渗溶液中红细胞溶血现象6溶液种类溶血与否时间结果分析0.17mol/L氯化钠0.17mol/L氯化铵0.17mol/L醋酸胺0.17mol/L硝酸钠0.12mol/L草酸铵0.12mol/L硫酸钠0.32mol/L葡萄糖0.32mol/L甘油0.32mol/L乙醇0.32mol/L丙酮五、注意事项（或实验特别提示）六、实验报告1、结果与讨论2、思考题实验3细胞器线粒体的分离与观察一、实验目的用差速离心法分离动、植物细胞线粒体二、实验原理线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、7半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（janusgreenB）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。本实验介绍大鼠（动物）肝脏和玉米（植物）线粒体的分离。三、实验器材与试剂四、实验步骤一、大鼠肝脏线粒体的分离实验用品1、材料：大鼠肝脏2、试剂：（1）生理盐水（2）1％詹纳斯绿B染液，生理盐水配制（3）蔗糖－Tris盐酸缓冲液（pH7.4）0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4）0.1mol/LTris10ml0.1mol/L盐酸8.4ml加重蒸水到100ml加蔗糖到0.25mol/L。蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4）配制如上，加蔗糖到0.34mol/L。（4）固定液：甲醇－冰醋酸（9：1）（5）Giemsa染液：Giemsa粉0.5g，甘油33ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研钵内，研磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，56左右保温2h，令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为Giemsa原液，保存于棕色瓶中。用时吸出少量8用1/15mol/L磷酸缓冲液作10～20倍稀释。1/15mol/L磷酸缓冲液（pH6.8）：1/15mol/LKH2PO450ml1/15mol/LNa2HPO450ml3、器材高速离心机，解剖刀剪，小烧杯，冰浴盘，漏斗，尼龙织物，玻璃均浆器。实验方法1．制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0～4°C的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0~4°C条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆，蔗糖溶液分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。2．差速离心先将9ml0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心的加入9ml肝匀浆使其覆盖在上层。用冷冻控温高速离心机按照图1顺序进行差速离心。鼠肝匀浆700g，离心10min沉淀上清洗涤（可省略）10ml预冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液，2次，每次1000g，离心15min。沉淀I细胞核及质膜碎片上清合并10000g，离心10min沉淀洗涤（可省略）加10ml预冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液，1000g，15min。沉淀II（线粒体）9图1差速离心顺序图3．分离物鉴定（1）细胞核：取细胞核沉淀一滴涂片，在甲醇－冰醋酸溶液中固定15min，充分吹干，滴Giemsa染液（原液10～20倍稀释）染色10分钟。自来水冲洗，吹干，镜检。观察结果。（2）线粒体：取线粒体沉淀涂片，注意勿太浓密，不待干即滴加1％詹纳斯绿B染液染色20min，盖上盖玻片镜检。观察结果。二、玉米线粒体的分离从植物细胞中分离线粒体，除了做线粒体功能测定之外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心法。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。实验用品1、材料玉米黄化幼苗（水稻、高梁等幼苗均可）2、试剂（1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/LEDTA，0.75mg/mlBSA。50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）配法：50ml0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与42ml0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。（2）保存液：0.3mol/L甘露醇（pH7.4）（3）20％次氯酸钠（NaClO）溶液（4）1％詹纳斯绿B染液，生理盐水配制。3、器材温箱，冰箱，纱布，瓷研钵，冷冻控温高速离心机实验方法1、玉米种子用20％次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持温度，置温箱28于暗处培育2～3d。待芽长到1～2cm长时剪下约5g，放0～41h。2、加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。3、用多层纱布过滤，滤液经700g离心10min。除去核和杂质沉淀。4、取上清液10000g离心10min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。5、沉淀为线粒体，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上匀