《中国药典》2010版二部生化药品增修订概况与解读--梁翠荣

《中国药典》2010版二部生化药品增修订概况与解读梁翠荣山东省药品检验所2010版药典宗旨：提高药典质量，应用高新技术，解决安全隐患，赶超国际水平。生化药的定义生化药主要从动、植物及微生物发酵提取的、化学合成、生物-化学半合成或用现代生物重组技术制得的一类药品。2010版药典收载品种氨基酸及其衍生物核苷酸及其衍生物酶与辅酶多肽及蛋白类多糖及脂类增修订概况1.凡例:增加对制法的要求2.正文:收载标准189个，增加36个，修订144个,删除2个。3.附录:增加2个(1)蛋白质含量测定法(2)合成多肽中的醋酸测定法修订1个电泳法增订第六法等电聚焦水平板电泳法凡例制定“制法要求”的准则1.用于注射用的或直接与伤口接触的提取类原料(凝血酶冻干粉)，应在原料的质量标准中增加“制法要求”。2.其他剂型不在其相应原料的质量标准中增订“制法要求”，而由凡例统一规范。凡例制法项下主要记载药品的重要工艺要求和质量管理要求所有药品的生产工艺应经验证,并经国务院药品监督管理部门批准,生产过程均应符合GMP的要求。来源于动物组织提取的药品，其所用动物种属要明确，所用脏器均应来自经检疫的健康动物，涉及牛源的应取自无牛海绵状脑病地区的健康牛群；来源于人尿提取的药品，均应取自健康人群。上述药品均应有明确的病毒灭活工艺要求以及质量管理要求。直接用于生产的菌种、毒种、来自人和动物的细胞、DNA重组工程菌及工程细胞,来源途径应经国务院药品监督管理部门批准,并应符合国家有关的管理规范。附录蛋白质含量测定法凯氏定氮法福林酚法双缩脲法2，2’-联喹啉-4，4’-二羧酸法考马斯亮蓝法紫外-可见分光光度法附录注意各测定法依据的蛋白质反应原理不同，线性范围不同，同时由于各品种的蛋白质性质，结构的迥异导致同品种采用不同的测定方法其结果有较大差异。不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应的方法学验证。常用的对照品有牛血清白蛋白、人血白蛋白、酪蛋白、免疫球蛋白及各品种的自身对照品。应尽可能选用与待测品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。附录合成多肽中的醋酸测定法为合成多肽中的醋酸检查，提供统一的方法。色谱条件与系统适用性试验：C18柱210nm检测流动相A:0.07%磷酸溶液(pH3.0)流动相B:甲醇理论板数按醋酸峰计算不低于2000梯度洗脱1.2ml/mlin时间(min)流动相A(%)流动相B(%)0～59555～10505010～20505020～2295522～30955附录注意对照品溶液：取冰醋酸适量，精密称定，用流动相A-流动相B(95:5)的混合溶液制成约0.1mg/ml（浓度可随供试品中醋酸的含量适当调整）供试品溶液：按各品种项下规定的方法制备。醋酸峰的保留时间约在3～4min，采用梯度洗脱，主要是让多肽组分从色谱柱中洗脱出来。附录合成多肽醋酸限度生长抑素3.0%～15.0%胸腺法新（胸腺肽α1）不得过5.0%鲑降钙素4.0%～15.0%醋酸丙氨瑞林不得过7.5%醋酸奥曲肽5.0%～12.0%2010版生化药标准品种数汇总类别2005版标准（品种）2010版标准（品种）增加标准（品种）标准（品种）增长%删除氨基酸及其衍生物42（22）52（25）10（3）23.8%（14%）核酸及其衍生物44（10）51（11）7（1）15.9%（10%）酶与辅酶28（11）34（14）6（3）21.4%（27%）多肽、蛋白26（11）30（13）8（3）30.8%（27%）2多糖15（5）19（6）3（1）20.0%（20%）脂2（1）4（2）2（1）100.0%（100.0%）总数157（61）189（71）36（12）22.9%（19.6%）2氨基酸及其衍生物品种与剂型氨基酸收载品种（25个）较全，几乎包含国内外所有的氨基酸原料，包含的剂型有片剂、注射液、胶囊剂、滴眼液、颗粒剂、口服溶液剂及冲洗液。项目鉴别：单一氨基酸品种的标准中统一增订了专属性较强的TLC法，有的品种同时用红外光谱法；氨基酸衍生物用红外光谱法。检查：其他AATLC法和HPLC法部分品种热原修订为细菌内毒素滴眼液品种增订渗透压摩尔浓度含量测定：滴定法、比色法及HPLC法。核苷酸及其衍生物品种与剂型收载品种（11个）和剂型较全，剂型有片剂（片、含片、咀嚼片）、注射剂（小针、输液、粉针）胶囊剂、乳膏剂、滴眼液、滴鼻液、颗粒剂及口服溶液剂。项目检查：溶液的澄清度与颜色有关物质TLC法和HPLC法残留溶剂、炽灼残渣等输液、滴眼液品种增订渗透压摩尔浓度复方葡萄糖输液增订5-羟甲基糠醛(HPLC法)部分品种热原修订为细菌内毒素含量测定：UV及HPLC法。盐酸阿糖胞苷上海所起草，天津所、广东所复核，达到国外标准。增订项目6项：1.溶液的澄清度与颜色2.含氯量（电位滴定法）：按无溶剂的干燥品计算，含氯量应为12.4%～12.9%。3.有关物质（HPLC法）4.残留溶剂（GC法）：甲醇（0.3%）、乙醇（0.5%）5.炽灼残渣不得过0.5%6.重金属（附录ⅧH第二法）不得过百万分之二十。含量测定：由UV-E法修订为HPLC法。有关物质（HPLC法）色谱条件：C18柱254nm检测流动相A:磷酸盐缓冲液(pH7.0）-甲醇（98：2）流动相B:磷酸盐缓冲液(pH7.0）-甲醇（70：30测定方法：加校正因子的主成分自身对照法已知杂质3个（尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷）对盐酸阿糖胞苷峰的相对保留时间分别为0.55、1.14、1.62；校正因子分别为2.9、1.72、1.54；未知杂质2个，对盐酸阿糖胞苷峰的相对保留时间约为0.38、0.43的校正因子均为1.72；其他杂质峰的校正因子均按1.1计算。计算公式：限度：尿嘧啶、尿苷均不得过0.1%；阿糖尿苷不得过0.3%；其他单个杂质不得过0.1%；所有杂质总和不得过0.3%。)/)(/(100stFrrWC酶与辅酶品种与剂型收载品种（14个），剂型有片剂（片、肠溶片）、注射剂(小针、粉针)、胶囊剂(软胶囊、胶囊)、颗粒剂。项目检查：溶液的澄清度与颜色有关物质(纯度、高分子物质)HPLC法(分子排组色谱法)部分品种热原修订为细菌内毒素效价测定：每1mg的效价不得少于XX单位，修订为每1mg中XX酶的活力不得少于XX单位。如抑肽酶,按干燥品计算,每1mg的效价不得少于3.0单位,修订为按无水物计算,每1mg抑肽酶的活力不得少于3.0单位。抑肽酶该品种由上海药检所起草Chp2005、Bp2008/Ep6.0、USP32版均收载，本版继续收载，但依据USP作了三个方面的修订。有效控制抑肽酶产品的纯度，使标准的制定达到或超过国外标准。1.检查高分子蛋白（USP32）关键是采用三根串联Gel色谱柱（TSK-G4000SWXL柱）柱温35℃280nm检测流动相:3mol/L醋酸溶液流速1.0ml/min,二聚体（112℃加热2小时)相对RT0.9，分离度＞1.0，拖尾因子≤2.5。限度：高分子蛋白（RT＜抑肽酶）峰的总量不得大于1.0%。2.检查去丙aa-去甘aa-抑肽酶和有关物质参照USP32采用新增附录毛细管电泳法：我国第一个用该法上药典的品种。3.检查N-焦谷氨酰-抑肽酶和有关物质（参照USP32）色谱柱：TSK-GELIC-Cation-SW柱温40℃210nm检测柱温：40℃流动相：A磷酸盐缓冲液B磷酸盐-硫酸铵缓冲液梯度洗脱相对RT0.9，分离度＞1.0，拖尾因子≤2.0。限度：不得大于1.0%；单个未知杂质不得大于0.5%；未知杂质总和不得大于1.0%多肽及蛋白类品种与剂型收载品种13个，少部分为脏器提取的激素、肽类。安全性无法保障的品种如垂体后叶粉、注射液等删除。合成肽类药品，纯度较高、质量优良，大部分质量标准与国际接轨。剂型多为注射剂。项目高分子蛋白有关物质相关蛋白（蛋白质就是由多个氨基酸残基组成的多肽链。一般以51个aa残基，分子量为5778的胰岛素划分,高于此分子量的称为蛋白,小于此的为肽)含量测定：HPLC法，部分肽和小分子蛋白中的生物活性、生物鉴别由化学测定法代替。金属离子：原子吸收光谱法安全性检查：细菌内毒素、异常毒性、微生物限度、过敏等。胰岛素ChP2010版依据USP33、EP6.0标准，参照2005版分别对来源、性状、鉴别、检查项下含量测定项、活性检查作了修订和补充（该品种江苏所起草，中检所复核）1.鉴别：由HPLC法改为肽图分析,经V8酶水解胰岛素,对其分子碎片中的肽图进行分析,该法能确定不同种属的胰岛素,专属性强。2相关蛋白：参照USP32、EP6.0由聚丙烯酰胺凝胶电泳改为分离度较好的HPLC法，214nm检测梯度洗脱限度：A21脱酰胺胰岛素5.0%，其它相关蛋白5.0%。3.高分子蛋白：将一般柱色谱改为分子排阻色谱，色谱条件与系统适用性试验均与ChP2005重组人胰岛素标准一致。限度：保留时间小于胰岛素的所有峰面积之和1.0%。4.锌检查：由比色法该为原子吸收光谱法。5.增加细菌内毒素、微生物限度检查。6.含量测定：用HPLC法代替生物活性测定法。考虑到胰岛素生物活性的重要性，原料在检查项中增加生物活性测定，参考USP32，动物数减半，生物统计简化，作为限度实验，使该法常规测定时既能省时、省力、省成本，又能有效控制质量。多糖及脂类糖类主要分类单糖(简单的多羟基醛或酮）如六碳糖(葡萄糖、果糖)、五碳糖(核糖)聚糖(单糖缩合而成)，20个单糖结构以下的为低聚糖,蔗糖、麦芽糖等,20个以上的为多糖。纯多糖：右旋糖酐、香菇多糖；杂多糖：肝素、硫酸软骨素、透明质酸等。品种与剂型多糖类硫酸软骨素钠、片、胶囊肝素钠、注射液、乳膏右旋糖酐铁、片、注射液右旋糖酐20、氯化钠注射液、葡萄糖注射液右旋糖酐40、氯化钠注射液、葡萄糖注射液右旋糖酐70、氯化钠注射液、葡萄糖注射液脂类前列地尔、注射用前列地尔多烯酸乙酯、软胶囊增修订项目金属离子：原子吸收光谱法有关物质：HPLC比活肝素钠150U/mg→170U/mg含量测定：HPLC、GC比旋度肝素钠不小于+35°→不小于+50°残留溶剂输液品种增订渗透压摩尔浓度复方葡萄糖输液增订5-羟甲基糠醛（UV法）甲氧基苯胺值硫酸软骨素钠中检所起草该品种质量指标有显著性提高,含量测定从原来比色法的40%左右，直提至90%（口服）。用专一性强且灵敏的酶解法，分解硫酸软骨素成A、B、C，再用离子色谱法分离硫酸软骨素成B、C和A，按外标法，以峰面积之和计算，使硫酸软骨素含量为90%～105%。灵敏度优于USP和EP，光电滴定法，因无专属性，其它多糖混杂，使硫酸软骨素含量偏高。含量测定：离子色谱法色谱条件：强阴离子交换柱232nm检测梯度洗脱流动相A:水(稀盐酸调pH值至3.5）流动相B:2mol/L氯化钠溶液(稀盐酸调pH值至3.5）酶解法：供试品用水制成100mg/ml溶液，取100μl，加Tris(pH8.0)缓冲液800μl，再加硫酸软骨素ABC酶（用Tris(pH8.0)缓冲液制成1单位/ml溶液）液100μl，37℃水浴反应1小时，100℃加热5分钟，冷却，离心20min(10000r/min)，取上清液，滤过，进样20μl。另取硫酸软骨素对照品，同法操作。甲氧基苯胺值测定原理油脂中的不饱和脂肪酸，被氧化成过氧化物，过氧化物进一步分解生成醛类或酮类，醛类或酮类可与对甲氧苯胺反应生成在350nm有吸收的物质。测定方法（避光快速操作）精密称取供试品约0.50g(W)，置25ml量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液5ml置具塞试管中，再精密加入0.25%4-甲氧基苯胺的冰醋酸溶液（临用新配）1ml，加塞，振摇，避光放置10分钟；另精密量取异辛烷5ml代替供试品溶液，同法操作，制成试剂空白溶液。以试剂空白溶液作空白，在350nm波长处测得的吸收度为A2。取供试品溶液，在350nm的波长处，以异辛烷溶液作空白，测得的吸收度为A1。