分解纤维素的微生物的分离

分解纤维素的微生物的分离1纤维素的化学组成纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。2纤维素的分布一、基础知识（一）纤维素与纤维素酶免、牛、蘑菇能利用纤维素。因为在草食性动物的消化道内共生有分解纤维素的微生物，这些微生物产生的纤维素酶分解纤维素；而人的消化道内没有这些微生物；蘑菇自身产生纤维素酶分解纤维素。人、兔、牛、蘑菇谁能利用纤维素？为什么？纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？40%—60%纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素3、纤维素酶的组成如何？有什么作用？怎样验证它的作用？1U表示的含义是什么？（2）纤维素酶的作用（1）纤维素酶的组成①取二支20mL的试管②各加入一张滤纸条③各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml甲乙④在乙试管中加入1mL纤维素酶⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h⑥结果：乙试管的滤纸条消失讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？（3）纤维素酶作用的验证实验在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。〖思考〗实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？滤纸崩溃法a能够利用秸秆等废弃物生产酒精。b用纤维素酶处理服装面料等。（4）1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25℃，其他条件，如PH等，均为最适的情况下，在1min内转化1mmol底物所需的酶量。5、研究分解纤维素的微生物有什么意义（应用价值）？1、筛选纤维素分解菌的方法是______________。该方法可以通过________反应直接筛选。刚果红染色法颜色〖思考〗如何筛选纤维素分解菌？依据什么原理？二、纤维素分解菌的筛选2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成____________，当纤维素被_________分解后，红色复合物无法形成，出现以_____________为中心的________，我们可以通过____________来筛选纤维素分解菌。红色复合物纤维素酶纤维素分解菌透明圈是否产生透明圈四种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈【方法点拨】刚果红染色法方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在倒平板时就加入刚果红。染色法优点缺点方法一方法二颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐；刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便；不存在菌落混杂问题产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。【典型例题】纤维素分解菌能够产生纤维素酶分解纤维素。回答下列问题：(1)在筛选纤维素分解菌的过程中，通常用________染色法，这种方法能够通过颜色反应直接对纤维素分解菌进行筛选。甲同学在实验时得到了如图所示的结果，则纤维素分解菌位于()A．③B．①②C．②③D．①②③(2)乙同学打算从牛胃中分离纤维素分解菌并计数，与分离醋酸菌相比，进行培养时除了营养不同外，最主要的实验条件差别是______________________，该同学采用活菌计数法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目________。刚果红A保证无氧环境小【变式训练】下列有关“分解纤维素的微生物的分离”实验几种说法中，正确的是（）A.纤维素酶中C1酶和葡萄糖苷酶都能将纤维素分解成纤维二糖B.选择培养基应以纤维素为唯一碳源，得先培养微生物，再加入刚果红C.应先通过固体选择培养基增加纤维素分解菌的浓度，以保证筛选效果D.菌落上的透明圈不一定是能分解纤维素的微生物所形成D二、实验设计土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上；本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本相同。①分布环境1、土壤取样：富含纤维素的环境中操作步骤生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。②原因（P28旁思：为什么在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？）③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。④讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。2、选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。①目的：②制备选择培养基：③操作：将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。纤维素分解菌选择培养基成分分析培养基组成提供主要的营养物质纤维素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、无机盐KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g无机盐酵母膏0.5g特殊营养物质、碳源、氮源水解酪素0.5g氮素、特殊营养物质溶解后，蒸馏水定容至1000mL水在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？注意：该步骤也可省略，但纤维素分解菌较少。按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。3.梯度稀释1011021031041051064.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上⑴制备培养基:参照课本旁栏中的比例配制。⑵倒平板操作。⑶涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。培养基组成提供的主要营养物质CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、特殊营养物质KH2PO40.25g无机盐土豆汁100mL碳源、特殊营养物质琼脂15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠)在产生纤维素酶的菌落周围会出现透明圈，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－370C培养，可获得纯化培养。5、挑选产生透明圈的菌落比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选择培养基原理培养基类型目的将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上将细菌培养在纤维素粉为主要碳源的选择培养基上固体培养基液体培养基筛选菌株选择培养，增加浓度分离纤维素分解菌的培养基和分离分解尿素的细菌的培养基的比较。比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌鉴别培养基原理现象方法细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后，红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有红色的环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌尿素为唯一氮源的培养基上加入酚红指示剂刚果红染色法【典型例题】某些农作物秸秆富含纤维素，纤维素经过水解可以形成葡萄糖，葡萄糖再经过发酵可以生产酒精。如图是利用农作物秸秆生产酒精的大致流程，请回答下列问题：农作物秸秆含有丰富的纤维素，纤维素可以经过纤维素分解菌分解成葡萄糖。人们常常从土壤中分离纤维素分解菌。筛选纤维素分解菌常用的方法是__________________。其实验流程是：土壤取样→选择培养→________→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生__________的菌落。刚果红染色法梯度稀释透明圈【变式训练】下面从土壤中筛选纤维素分解菌的实验步骤，正确的是()①土壤取样②称取10g土壤加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中③吸取0.1mL进行平板涂布④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度A.①→②→③→④B.①→③→②→④C.①→②→④→③D.①→④→②→③C点拨：在分离土壤中某细菌时，应先选取土样(10g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。三、结果分析与评价（一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落（二）分离的结果是否一致设置对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。由于在土壤中的细菌远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，也可能得到真菌和放线菌等不同结果。四、课题延伸为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。【典型例题】培养基酵母膏无机盐淀粉纤维素粉琼脂CR溶液水甲＋＋－＋－＋＋乙＋＋＋－＋＋＋为从富含纤维素分解菌的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落并加以鉴定，某同学设计了甲、乙两种培养基：注：“＋”表示“有”，“－”表示“无”。据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离纤维素分解菌，原因是__________________________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于鉴定纤维素分解菌，原因是__________________________________________。不能液体培养基不能分离单菌落不能培养基中没有纤维素【变式训练】某校生物兴趣小组研究发现，秸秆还田的过程中施加外源纤维素酶能起到较好的效果。下列有关叙述错误的是：（）A.纤维素酶是一种复合酶，其中纤维二糖酶能够将纤维素分解为纤维二糖B.纤维素分解菌主要分布于富含纤维素的环境中，纤维素分解菌常用刚果红染液进行鉴定C.菌落周围的透明圈大小可以反应纤维素分解菌产生的酶的多少D.为了确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产生纤维素酶的实验A分解纤维素的微生物的分离纤维素酶种类、作用、催化活力刚果红染色筛选原理实验设计土壤取样选择培养涂布培养纯化培养前置染色法后置染色法富含纤维素土壤增大分解菌含量染色鉴别分离出分解菌【课堂小结】