血栓与止血的筛选试验及其临床应用

血栓与止血的筛选试验及其临床应用上海交通大学医学院附属瑞金医院王鸿利王学锋•迄今，检测血栓与止血的试验逾百种，大致可分为筛选试验、确诊试验、排除试验和基因分析等四大类。本文仅就筛选实验，如出血时间（BT）、血小板计数（PLT），活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT），纤维蛋白（原）降解产物（FDPs）、D-二聚体（D-D），血小板功能分析仪（PFA-100）、血栓弹力图（TEG）的检测其临床应用作一简述。•图1血管内皮细胞与止血系统（一）一期出血缺陷筛检试验的应用•1.一期止血缺陷是指血管壁和血小板异常所引起的止血功能缺陷，主要是由于毛细血管壁通透性、脆性增加或血小板数量、质量异常所致的出血。•2.临床特点出血以皮肤、黏膜为主，重者可伴有内脏出血；但肌肉、关节等组织出血罕见。对压迫、缝合、外用止血剂或输注血小板治疗有效，但对血浆和血浆凝血因子制品无效。•3.筛选试验出血时间（BT）血小板计数（PLT）筛选试验1.出血时间（BT，模板式刀片法/出血时间测定器法）反映毛细血管壁与血小板相互作用：毛细血管的完整性、收缩性以及血小板数量、功能的实验。•参考范围：TBT法：6.9±2.1min•临床意义：BT延长（＞9.0min）（1）PLT↓与BT↑呈负相关，PLT愈↓BT愈↑。（2）血小板功能异常：血小板无力症、巨血小板综合征、灰色血小板综合征等。（3）部分凝血因子缺乏：低/无纤维蛋白原血症、血管性血友病（vWD）等。（4）遗传性出血性毛细血管扩张症。（5）药物：阿司匹林（ASA）、氯吡格雷（玻立维）和阿昔单抗等。•方法学评价上海瑞金医院对126例ITP和20例vWD患者检测BT结果列于表1；对BT的三种方法比较见表2。表1ITP和vWD应用两种BT法检测的结果nBT延长率（%）PLT（×109/L）Duke法出血时间测定器法*ITP126＞701.612.770～506.336.750～3029.674.6＜3042.992.4vWD2032.667.4*P＜0.01•表2三种BT检测方法的比较TBT法TvY法Duke法刺血部位前臂，个体差异小同左耳垂，个体差异大固定加压上臂，成人53kPa同左无切口标准化深度、长度固定无无敏感性+++++-精确度+++++-操作繁较繁简单使用国际标准已趋不用弃用参考值6.9±2.12～71～4•2.血小板计数（PLT）单位容积的循环血液中所含血小板的数量（×109/L）。•方法：（1）直接血小板计数法（普通显微镜法/相差显微镜法）；（2）血液分析仪（电阻抗法/光散射法）；（3）流式细胞仪法。•参考范围：国内：85～320×109/L（成人）；通常是100～300×109/L。•临床意义（1）血小板减少（＜100×109/L）：PLT＞50×109/L，出血少见；50～30×109/L，外伤性出血；＜20×109/L，自发性出血，常需输注血小板制品。•血小板减少原因：生成减少、破坏增多、消耗过多、分布异常等。（2）血小板增多（＞400×109/L）：PLT400～600×109/L，需观察；PLT＞600×109/L，需治疗；PLT＞600×109/L，需血小板分离。•血小板增多原因：骨髓增生性疾病、反应性血小板增多。•方法学评价ICSH推荐：一般用血涂片法观察血小板分布并与计数核实。（1）草酸胺稀释-相差显微镜计数血小板；（2）流式细胞术计数。经国际11个实验室用CD41、CD61验证，该法准确度、精密度很好，可作为自动血细胞分析仪的校准和PLT减少的准确性的验证。图2一期止血缺陷的筛选试验•图3先天性初期止血异常的实验室检查获得性初期止血异常的实验室检查（二）二期止血缺陷筛检试验的应用1.二期止血缺陷是指凝血障碍和抗凝物质所引起的止血功能缺陷，主要是由于凝血因子缺乏或体内产生病理性抗凝物质所致出血。2.临床特点出血以肌肉、关节为特点、也可有内脏、皮肤出血对血浆、血浆凝血因子制品有效，但对压迫、外用止血剂和输血小板疗效欠佳。3.筛选试验活化部分凝血活酶时间（APTT）血浆凝血酶原时间（PT）图4凝血系统及其筛选实验1.活化的部分凝血活酶时间（APTT）APTT是内源凝血途径的常用和较敏感的筛选试验。•参考范围：传统的是31～43s；目前随着仪器和试剂的开发，其参考值不一，尚难统一。•正常对照值：传统的须测对照值，以测定值较对照值延长＞10s为异常；目前也未统一。•APTTR：患者APTT/正常对照APTT比值，尚未得出参考范围，尚未推广应用。•临床意义（1）内源性凝血途径因子缺陷：FⅧ（血友病A）、FⅨ（血友病B）、FⅪ、FⅫ、PK和HMWK等遗传性缺乏症。（2）内源性凝血途径因子抑制物存在：常见FⅧ、FⅨ抑制物，狼疮抗凝物（LA），应选用鞣花酸为激活剂更敏感。（3）药物所致异常：常见肝素（患者APTT/正常人APTT比值为1.5～2.5为治疗范围）、输注库血引起凝血病等。（4）纤溶活性增强：尤其是多见于继发性纤溶亢进（DIC），而原发性纤溶很少延长。•方法学评价（1）激活剂：白陶土、硅藻土和鞣花酸的敏感性比较，见表3表3不同激活剂对APTT敏感度比较对凝血因子对肝素对LA抗凝物白陶土+++++++硅藻土++++++++鞣花酸++++++（2）凝血时间检测的敏感性比较：瑞金医院对血友病患者凝血时间的敏感度作比较,延长率（%）：APTT95%，硅管法CT100%，ACT100%，而试管法CT为70%，故目前用APTT为筛选实验简单、方便、实用。2、血浆凝血酶原时间（PT）PT是外源凝血系统常用和较为敏感的筛选实验。•参考范围：传统法为12±1s（11～13s）；目前，随着仪器和试剂不同，参考范围也有不同。尚未统一。•正常对照组：传统法为测定值较正常对照组＞3s为异常，目前也未统一。•PTR参考范围：1.00±0.05，已在应用。•临床意义（1）PT延长：见于遗传性/获得性外源凝血系统的凝血因子缺乏；获得性常见于DIC、依K因子缺乏、口服抗凝剂、肝病；循环血抗凝物质：肝素、FDP、抗因子抗体。（2）PT-INR多用于监测口服抗凝剂（华法林）。INR＜1.5提示抗凝剂无效；INR1.5～2.0用于预防；INR2.0～2.5常规抗凝；INR2.5～3.0重度抗凝；INR＞3.0易致出血。方法学评价（1）Hct＜30%或＞50%，抗凝剂和血液的比例应按下式调整（表4）抗凝剂量（mL）=（100-Hct）×血液量（mL）×0.00185表4Hct对PT和APTT测定结果的影响Hct（%）PT（s）APTT（s）1010.0±0.624.3±3.22010.4±0.228.3±1.44511.1±0.733.3±4.36013.5±1.537.2±4.07014.9±1.038.5±3.18052.5±7.760.5±10.3（2）凝血活酶（组织因子）：兔脑、人脑、重组组织因子（rTF）对PT的结果，不尽相同。rTF＞人脑＞兔脑（3）缓冲剂其维持血浆pH，防止易变因子失活；如果无缓冲剂，血浆pH增加，PT延长。（三）、筛选试验的联合应用•主要是PT、APTT和PLT的联合应用。1）PT（N）、APTT和PLT（N）2）PT（↑）、APTT（N）和PLT（N）3）PT（↑）、APTT（↑）和PLT（N）4）PT（↑）、APTT（↑）和PLT（↓）5）PT（N）、APTT（N）和PLT（↑）6）有出血症状，但PT（N），APTT（N）和PLT（N）图3先天性凝血异常的实验室检查•表获得性凝血性障碍项目的选择和应用（四）纤溶活性增强筛选试验的应用1、原发性纤溶性增强指组织型纤溶酶原激活物（t-PA）或尿激酶型纤溶酶原活物（u-PA）的活性增强所致纤溶性亢进2、继发性纤溶活性增强几乎都见于DIC，是指因子Ⅻa激活激肽释放酶原（PK）生成激肽释放酶（KK），KK激活纤溶系统所致纤溶活性增强。3、筛选试验纤维蛋白（原）降解产物（FDP）测定D-二聚体测定（D-D）图5FDP和D-D的生成1、纤维蛋白原（Fg）和纤维蛋白（Fb）降解产物（FDPs）测定指纤溶酶同时降解Fg和Fb产生的FDPs。（1）定性试验：胶乳凝集法。•阴性：血清FDP含量＜10μg/mL，血浆FDP含量＜5μg/mL，尿液FDP含量＜2μg/mL。•阳性：血清FDP含量≥10μg/mL，血浆FDP含量≥5μg/mL，尿液FDP含量≥2μg/mL。（2）定量试验：ELISA法。包被于固相的FDP抗体与样本中FDP（抗原）结合，加入酶标抗体后形成夹心复合物，呈显色反应。参考值：＜5μg/mL。2、D-二聚体（D-D）测定指纤溶酶特异性降解纤维蛋白（Fb）所产生的降解产物。（1）定性试验：胶乳凝集试验。•阴性：无凝集颗粒者，即D-D含量＜0.5μg/mL•阳性：有凝集颗粒者，即D-D含量≥0.5μg/mL•半定量：以＜0.5μg/mL、≥0.5μg/mL×阳性时的最大稀释倍数。（2）定量试验：ELISA法。参考范围：＜0.5μg/mL（3）定量试验：胶体金法。将血浆加入检测卡孔内，血浆中D-D吸附于包被有D-D单抗膜中，再加入D-D单抗-胶体金耦联物溶液，膜中D-D将与金标抗体发生结合反应，用光笔阅读仪读数。参考范围：＜0.3mg/L临床应用（1）纤溶活性增强筛检试验的应用FDP正常，D-D正常：多数为正常人，提示无纤溶过度现象。FDP阳性，D-D正常：多数为FDP的假阳性或原发性纤溶症。FDP正常，D-D阳性：多数为FDP假阴性或继发性纤溶症。FDP阳性，D-D阳性：多数为继发性纤溶症，常见于DIC。（2）在诊断DIC中的应用见表5表5FDP和D-D在诊断DIC中的应用异常标准敏感性（%）特异性（%）诊断效率%）FDP＞10mg/L1006787D-D＞0.25mg/L916880FDP+D-D919495•(3)D-D在排除静脉血栓（VTE）中的应用D-D测定在排除VTE中有重要价值（表6）。表6D-D测定在排除VTE中的应用对DVT对PTE敏感性（%）特异性（%）NPV（%）敏感性（%）特异性（%）NPV（%）胶乳法79～10076～10094～10098～100ELISA法94～10033～5292～10096～10035～5299～100方法学评价（1）对VTE的诊断：D-D测定有高度敏感性和阴性预测值，但特异性较低。因此，D-D测定阴性可排除VTE，阳性不一定是VTE。（2）D-D测定，WHO规定用ELISA法，临界值为500μg/L。因此D-D测定值＜500μg/L排除VTE，几乎为100%，＞500μg/L诊断VTE的可能性为40%，必须结合其他影象检查。（3）D-D测定阴性时，结合临床低/中危险度，其排除价值更大；D-D测定阳性时，结合临床高危险度和影象检查诊断价值更大。（4）FDP和D-D阳性可见于老年人、妊娠、癌肿、DIC、肝病、感染、炎症、创伤、手术、溶栓治疗、冠心病等。判断结果时要充分考虑。（五）DIC筛选试验的应用•诊断DIC必须符合下列4项：（1）引起DIC的基础疾病：病因诊断（2）有DIC的临床表现：临床诊断（3）DIC的实验室检查：实验诊断（4）对肝素治疗有效：治疗诊断临床应用1、国外DIC的记分诊断标准（表9）失代偿性（显性）DIC诊断标准代偿性（非显性）DIC诊断标准原发疾病存在2分2分原发疾病不存在0分0分plt（×109/L）＞1000分＞1000分＜1001分＜1001分＜502分动态观察：↑-1分，稳定0分，↓+1分SFMC/FDP不↑0分不↑0分中度↑2分↑1分高度↑2分动态观察：↓-1分，稳定0分，↑+1分2、国外DIC的记分诊断标准（表10）PT（s）失代偿性（显性）DIC诊断标准代偿性（非显性）DIC诊断标准未延长或延长＜3s0分未延长或延长＜3s0分延长3～6s1分延长＞3s1分延长＞6s2分动态观察：缩短-1分，稳定0分，延长+1分Fg（g/L）≥1.00分＜1.01分特殊检查：AT：正常-1分，↓1分；PC：正常-1分，↓1分；TAT：正常-1分，↓1分；PAP：正