光学显微镜培训内部讲义

1光学显微镜培训内部讲义2显微镜概念：广泛定义，能够将微观世界的物质形态展现在人眼前的设备就是显微镜。狭隘定义，光学显微镜钢铁组织图片(光学显微镜)蜘蛛照片（电子显微镜）人眼观察的局限性尽管科技在不断的发展，眼睛作为视觉器官同位于后面的大脑相配合，依然是目前最有效的成像系统。所有的科学仪器在速度和分辨率上与眼睛都无法相提并论。眼睛的构造类似于摄像机。肌肉调节的水晶体（1a）与角膜（1）的曲面将一幅图像投射在视网膜（2）上。入射光的强度则通过改变虹膜（3）的直径来控制。通过这种方法，眼睛可以把位于大约20cm到无限远距离内的任意物体，经由水晶体，靠肌肉灵活调节焦距，从而形成一幅清晰的图像。图像本身将会投射在视网膜上，经由大约130百万个柱状受体（识别黑白色）以及7百万个圆锥细胞（识别彩色）识别后，在最短的时间内，通过视神经传送至大脑。下图是的光线经由眼睛形成的视角为30°之后的图示，都是在同样的视角下观看。●从300m远的地方眺望161m高的乌尔姆大教堂（位于德国南部）。●从25cm处观看一幅高13cm的相片。3视角小意味着什么？因为我们想要进一步观察植物茎部的细微的毛细管，我们从茎部切出一片非常薄的切片，将它放置载玻片上并用盖玻片保护。当拿着做好的样品迎着光来观察时，我们依然无法观察到更多的细节。仅仅能观察到与之前一样的的组织。这些问题的原因很容易解释。我们想要观察的细节大概只有1/100甚至1/1000个毫米。然而在20cm以内，眼睛无法聚焦到20cm内任意位置。结果是我们得不到任何细节。类似情形就像我们要在300m远的地方去观察先前提到的乌尔姆教堂的塔尖。在这么远的距离上，石匠们所创造出许许多多的花纹将无法分辨出来，其原因就在于视角太小了。补救方法：放大镜一个几个世纪以来就众所周知的解决方法：放大镜。当把放大镜放在眼睛与被观察的物体之间时，所有的物体都被放大了。然而这种方法的局限性是：放大倍数要超过8倍或者10倍是不可能的。任何人想要观察更多的细节就必须使用“复合式”放大镜。4如果一个透镜的放大倍数不足以满足我们的需要，那么可以将若干个透镜一个接一个的排列起来。此时的放大效果将会是乘积式增大,即形成了显微镜。显微镜的发展史：早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像，后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。17世纪中叶，英国的胡克和荷兰的列文胡克，都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。1665年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜，其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出的成就。19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖显微镜的成像原理当把待观察物体放在物镜焦点外侧靠近焦点处时，在物镜后所成的实像恰在目镜焦点内侧靠近焦点处，经目镜再次放大成一虚像。观察到的是经两次放大后的倒立虚像5透镜的成像缺陷——像差像差就是指理想的成像和光学系统的实际成像之间的差异。无像差的成像，即理想成像的条件必须满足下述三点：（i）由一个点发出的、通过成像光学系统的所有光线应该归结于同一点。（ii）与光轴垂直的、同一平面上各点的成像点应该在同一平面上。（iii）与光轴垂直的、同一平面上的物体平面形状应该与成像平面上的形状有相似关系。但是，在实际的光学系统中，完全满足理想成像的条件很难做到，往往存在着影响成像性能的“像差”。1、色差：色差是不同颜色的光线穿过透镜之后汇聚在不同焦距上的现象。色差分为位置色差和放大率色差两种。位置色差使像在任何位置上观察都带有色斑与晕环，使图像模糊不清。放大率色差使像带有彩色边缘，同样影响像的清晰度和分辨率。6色差的校正：1、采用单色光源，但在日常工作中，单色光源无法获得真实的彩色图像信息，往往很少采用。2、利用凸、凹透镜组进行色差校正。是常规手段。2、球差：亦称球面像差。轴上物点发出的光束，经光学系统以后，与光轴夹不同角度的光线交光轴于不同位置，因此，在像面上形成一个圆形弥散斑，这就是球差球差会使一个光点成像后不再是一个亮点，而是一个中间亮，边缘逐渐模糊的亮斑。球差的校正依然采用凸凹透镜组来实现。3、慧差：彗差属轴外点的单色像差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜后，不再相交一点，则一光点的像便会得到一逗点壮，型如彗星，故称“彗差”。慧差因为会形成一个模糊的亮斑，因此会破坏图像的真实和清晰度。慧差的校正与球场的校正方式一样，都是通过凸凹透镜组来实现的。4、像散：当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾向大，经透镜成像后则引起象散。象散会使图像形成一个椭圆形的斑点，同样会影响图像的真实与清晰度。75、场曲：场曲因大视场所引起，使得图像变得弯曲。6、畸变：畸变是由于光束倾向度大而引起的，使像平面上个处的放大率不同，像的各部分表现出与原物体不成比例。显微镜的结构8光源（灯箱）灯箱，提供用户获得图像的光源，多采用卤素灯作为照明灯泡。分为反射光照明光源和透射光照明光源两种。反射光照明用户观察不透明或半透明材料，透射光照明用户观察透明材料。现有厂家的显微镜都采用柯勒式照明方式。9透射光科勒照明反射光科勒照明功能模块盒功能模块盒用于放置观察分析模块（棱镜），用于不同材料的各类分析用，可放置明场、暗场、偏光、微分干涉等分析模块。模块盒所能放置的模块个数各厂家的显微镜是有差异的。也是考量显微镜研究级别高低的一个参数。有些厂家的模块转换采用转盘形势，有些厂家采用推拉方式。物镜转盘物镜转盘用户放置物镜的地方，各厂家不同类型显微镜物镜转盘所能放置的物镜个数也不相同，显微镜倍数的改变就是通过拨转物镜转盘改变观察物镜来实现的。放置个数的多少也是衡量显微镜研究级别高低的一个参数。物镜物镜是由若干个透镜组合而成的一个透镜组。组合使用的目的是为了克服单个透镜的成像缺陷，提高物镜的光学质量。显微镜的放大作用主要取决于物镜，物镜质量的好坏直接影响显微镜映像质量，它是决定显微镜的分辨率和成像清晰程度的主要部件。10一、物镜参数-数值孔径数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是由物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径角的一半（a\2）的正弦值的乘积，其大小由下式决定：N.A=n*sina/2数值孔径简写NA(蔡司公司的数值孔径简写CF)，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低(即消位置色差的能力,蔡司公司的数值孔是代表消位置色差和倍率色差的能力),的重要标志。其数值的大小，分别标科在物镜和聚光镜的外壳上。显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率η值。基于这一原理，就产生了水浸系物镜和油浸物镜，因介质的折射率η值大于1，NA值就能大于1。数值孔径与其它技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其它各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，焦深与数值孔径的平方成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。二、物镜参数-分辨率分辨率是指显微镜能够区分的两个清晰点之间的最小距离。分辨率的高低决定了获得图像组织细节信息的多少。11同一样品不同分辨率下的图像效果500倍图像效果1000倍图像效果分辨率计算公式为：注明：利用公式所得到的分辨率为理论值，实际显微镜获得的分别率根据样品的不同、周围光线环境的不同、显微镜技术的不同会有较大的变化。因此通过公式计算的分别率只具有指导意义，不同厂家的实现技术不同，其获得的实际分辨率效果往往具有一定差距。提高分辨率的方法：1、利用短波长的光作为光源，但因为现有光学显微镜往往采用可见光作为光源以保证图像的颜色信息的真实性，因此更为有效的方式应该是增加短波长的通过率，在这一点上只有蔡司做的极为专业。2、增加NA值，因为物镜在制作完成后其NA值已经固定不变，因此实际所采用的手段就是更换物镜（高级别物镜、高介质折射率物镜、更高倍数物镜）。3、增加明暗反差，采用光路处理技术，降低光路中杂散光对成像质量的影响，也可以提高分辨率。三、物镜参数-放大倍数显微镜的放大倍数：是指物体经物镜放大在经过目镜放大后，人眼所看到的图像大小与原物体大小的比值。12显微镜常用的放大倍数有5、10、20、50、100几个倍数，有些倍数现有市场只有部分用户会使用如1.25、2.5、63、150等。显微镜的放大倍数是指长度的放大，而不是指面积的放大。显微镜总的放大倍数=物镜放大倍数×目镜的放大倍数。目镜常用的放大倍数为10倍，也被称为标准放大倍数，因此显微镜的总放大倍数最高不会超过1000倍。有效放大倍数：对于某一显微镜而言，在其可分辨能力之内的图像放大，叫做有效放大。此时的图像放大不失图像表面的细节。无效放大倍数：显微镜分辨能力以外的图像放大，叫做无效放大，无效放大只放大了图像的轮廓，而不能放大和分辨图像表面的细节。四、物镜参数-景深（焦深）景深：对焦点前后景物较为清晰的范围，即为景深。从对焦点至物镜前的最近清晰点为景深前界限，从对焦点至后面的最远清晰点为景深的后界限。从前界限至对焦点为前景深，从对焦点至至景深的后界限为后景深前后景深之和为全景深，简称景深。前景深的清晰范围小于后景深约为全景深的1/3。显微镜景深的计算公式：其中K为常数240um，M为显微镜总放大倍数通过公式我们可以了解到景深与放大倍数和分辨率是成反比的，因此在要求高数值孔径获得高分别率是一定会导致景深的降低。通过计算我们也可以知道显微镜的景深范围大致是从几微米——零点几个微米。这就要求我们的样本表面的高低起伏应该在微米级别内方可获得一幅清晰图像。因此显微镜下观察的样品都需要制样（使用的常用设备为切割机、镶嵌机、磨抛机）。因为样品的制备水平与实际操作人员的操作水平有一定的关系，因此高分辨率下的显微镜对于磨样人的水平是有一定严格要求的，也可以说只有在保证样品表面高低起伏在景深允许范围内的情况下，高分辨率才有意义。五、物镜参数—工作距离工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。13随着数值孔径的增大（分辨率的提高）工作距离会缩短，在某些特殊行业，对于物镜的工作距离是有特殊要求的，例如高温金相显微镜，因为物镜需要与热台保持足够长的工作距离，以避免温度过高而损害物镜，因此在相同倍数情况下，需要使用长工作距离物镜，因此也就损失了分辨率。物镜的分类：1、根据使用的介质折射率的不同：干燥系物镜，以空气作为介质，多用于材料学领域水浸系物镜，以水作为介质，多用户生命科学领域油浸系物镜，以香柏油作为介质，物镜外壳上标有OIL的字符，多用户煤炭、石油、地质等行业。2、根据色差校正程度的不同：消色差物镜,物镜外壳上常有（Ach）字符，现在各厂家很少对其标准，结构比较简单，仅能校正轴上点的位置色差（红、兰二色），成本较低。复消色差物镜，结构复杂，采用特种玻璃或萤石、氟石等材料制作，物镜外壳上标有APO符合。这种物镜可校正红、绿、蓝三色光的色差。对于各种像差的校正也极为完善，比相同倍数的消色差物镜具有更高的数值孔径。适用于高级研究。蔡司的AOP物镜可对七色光进行色差校正。半复消色差物镜，物镜外壳上标有FL符号，有些厂家不标，色差校正程度介于消色差物镜和复消色差物镜之间。是国内各进口显微镜厂家经常配的一种物镜。3、平场物镜，因为物镜都要进行场曲的校正，因此现在各厂家生产的物镜都为平场物镜，因此在物镜叫法上就有了平场