MIQE

MIQE-实时荧光定量PCR实验流程及数据处理的国际化标准及语言规则宗雅冬南京润亚公司定量PCR发展及遇到问题大量的科研工作使用定量PCR，每年产生大量的文章，但是-如何合理设计实验没有共识-如何描述实验结果没有共识（gene表达差异的柱状图，etc）-投稿时提供什么实验信息没有共识（自身说服力差、编审犯难、同行无法重复、出现大量错误结果）以Real-timePCR为关键词在NCBIPubmed检索结果存疑的数据Slope:-1.365Eff=440.26%Slope:-2.276Eff=175.02%召回的文章的国际标准：就评价qPCR实验和发表文章时所必需的实验信息提出了最低限度的标准。指南的作用•规范专业术语和概念–术语:referencegenes,qPCR,Cq(quantificationcycle)–概念:sensitivity,specificity,accuracy,repeatability,reproducibility•规范操作标准–样品获取、处理和制备–RNA或DNA质控–反转录–qPCR过程(酶,、耗材、特异性、引物序列、二级结构,、对照、校正)–数据分析(均一化,生物重复和技术重复)–评审可以更好的评估研究者所用的实验方案的有效性–确保结果的完整性和可靠性’saChecklist(检查清单)!–ExperimentalDesign（实验设计）–SampleInformation（样本信息）–NucleicAcidExtraction（核酸提取）–ReverseTranscription（反转录）–qPCRTargetInformation–（目的基因信息）–qPCROligonucleotides–（qPCR寡核苷酸）–qPCRProtocol（qPCR程序）–qPCRValidation（qPCR验证）–DataAnalysis（数据分析）•AChecklistof80+itemsthatdescribetheminimuminformationnecessarytoevaluateqPCRexperiments•Brokenintoessential(E)anddesirable(D)categoriesofinformation•Ideallythechecklistshouldbesubmittedwithmanuscriptsandavailableonlinetoresearchers(RDML)…-Noproofof100%efficienciesfrombothtargetgeneandreferencegene-Requestedtoprovidesupplementarydata启示:实验以前应该先研究一下这个指南实验设计-实验样品的分类，处理和对照都要具备并明确定义-重复数生物性重复：不同的材料（时间、植株、批次、反应板）做的同一实验-技术重复实际上就是同一材料包括的复孔-NTC用来验证实验材料是否具有污染。-NRT是未经反转录的RNA作为阴性对照。对gDNA残留的控制。（样本信息）判定材料的质量-对样品材料的描述-肿瘤里边切下的肿瘤材料是否带有健康组织，etc。-处理过程-是否是新鲜材料-存储方式、时间-医学里边，材料的固定和处理方式（核酸提取）™-RNA定量和完整性分析RNA分析•分光光度计•毛细管电泳•荧光定量•微流体电泳系统（MIQE推荐）电泳槽电源成像仪分析软件光密度仪*Generallyacceptedratios(A260/280andA260/230)forgoodqualityRNAare1.8.SampleConc(ng/ul)A260/280*A260/230*Control-noheat1151.902.443min@90C1141.932.405min@90C1152.062.3710min@90C1152.032.3715min@90C1162.022.311hr@90C1091.992.182hr@90C1172.002.324hr@90C1181.892.23RNA纯度和完整性RQIValue&ColorCodedClassificationExperionVirtualGelLC3’5’10’15’1h2h4hSamples6,7,8arehighlydegraded.反转录（一致性）IdealReality?RNAcDNAReproducibleDataNotReproducible不管targetgene的丰度如何、起始的RNA输入量如何，反转录的效率都是一致的确保cDNA的差异能够真实反映RNAi.e.基因表达的差异。不影响表达差异的判定。不管targetgene的丰度如何、起始的RNA输入量如何，反转录的效率都是一致的确保cDNA的差异能够真实反映RNAi.e.基因表达的差异。不影响表达差异的判定。:cDNAserialdilutionvs.totalRNAserialdilutionLogStartingQuantity(femtogramsofinputRNA)Note:1/10thofcDNAreactionusedforPCR123456789CycleThresholdNumbeT)510152025303540cDNAStandardCurveTotalRNAStandardCurvecDNAtotalRNASlope-3.394-3.382Corr.Coef.0.9990.999Intercept38.9138.09PCRefficiency97.1%97.6%反转录效率一致性可以通过预实验来判定•实验:梯度稀释RNA及cDNAiScriptcDNASynthesisKit://序列同源性分析(BLAST)（引物和探针）二级结构的影响及引物位置1110ForwardPrimerReversePrimerAPrimerBReversePrimerBPrimerB:h=95.8%PrimerA:h=66.3%PrimerA•Badlocationforprimers•Goodlocationforprimers55°C60°C•DesignsPrimers-singleplexassays•DesignsInternalOligos•Providesmultipleoutputs•FreeWebsoftwareprovidedbySteveRozenandWhiteheadInstituteforBiomedicalResearch.在线连接数据库-mFold,etc.-Multiplexassays（引物/探针资源共享）—Sso7d-fusionProteinTechnologySso7dfromSulfolobussolfataricus–7kD,63aa.–Thermostable(Tm90°C)–Nosequencepreference–BindstodsDNA(3-6bp/proteinmolecule)–MonomericSsoFastEvaGreenSupermix/SsoAdvancedSYBRGreenSupermix•MinimalinhibitionofPCRbyEvaGreen–ensuresmaximumefficiency,sensitivity,andreproducibility,whileprovidinghigherfluorescencecomparedtoSYBRGreenI.–Greaterfluorescenceprovidesextremesenstivity-detectonetargetmoleculeinareaction.•InstantpolymeraseactivationandrapidpolymerizationkineticsforfastqPCRresults