TaKaRa逆转录试剂盒

研究用CodeNo.RR037A说明书PrimeScript™RTreagentKit(PerfectRealTime)v201412Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存1●特长1●使用注意2●操作方法：反转录反应2●操作方法：RealTimePCR反应3●附录6●关联产品8●制品说明本制品是RealTimeRT-PCR用的最佳反转录反应试剂。使用具有较强延伸能力的PrimeScriptRTase可以在较短时间内高效合成RealTimePCR用cDNA。操作简单，适合进行高通量分析。进行2StepRealTimeRT-PCR反应时，与SYBR®PremixExTaqII(TliRNaseHPlus),SYBR®PremixExTaq(TliRNaseHPlus)或PremixExTaq(ProbeqPCR)试剂配合使用，能进行高性能的基因表达分析。本制品提供了SYBR®Green分析法和TaqMan®探针分析法各自最适反应体系，可以根据分析方法选择体系。●制品内容（10μl反应×200次）1.5×PrimeScriptBuffer（forRealTime）*1400μl2.PrimeScriptRTEnzymeMixI*2100μl3.OligodTPrimer（50μM）100μl4.Random6mers（100μM）400μl5.RNaseFreedH2O1ml6.EASYDilution（forRealTimePCR）*31ml*1含有dNTPMixture和Mg2+。*2含有RNaseInhibitor。*3制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TEBuffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASYDilution也可以单独购买（CodeNo.9160）。注意：EASYDilution请与本公司RealTimePCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。试剂盒外必备材料热循环仪（或37℃、42℃水浴和85℃加热块）反转录反应所用0.2ml和1.5ml的微量反应管微量移液器和枪头（高压灭菌）●保存：-20℃。●特长1．可以快速、高效合成RealTimePCR用cDNA，是进行2StepRealTimeRT-PCR反应的最佳试剂。2．含有OligodTPrimer和Random6mers两种反转录引物，可根据实际情况区别使用。反转录反应可以使用Random6mers或OligodTPrimer，也可以OligodTPrimer和Random6mers同时使用。只扩增一种目的基因时，也可以使用SpecificPrimer作为反转录引物。3．本制品提供了SYBR®Green分析法和TaqMan®探针分析法各自最适反应体系，可以根据分析方法选择体系。注意：以下是SYBR®Green分析法和TaqMan®探针分析法进行反转录实验的区别①用于反转录实验Random6mers添加量。②用于反转录实验totalRNA的添加量。4.RealTimeRTPCR定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总RNA和反转录cDNA稀释到较低的浓度。如果用水或TEBuffer稀释时，由于模板浓度低不稳定，因而会缩小曲线范围，结果精度降低。本制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASYDilution（forRealTimePCR），将TotalRNA或cDNA稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。-1-●使用注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。1．当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix；其中包括RNaseFreedH2O、Buffer、酶等），然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。2．PrimeScriptRTEnzymeMixI使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。同时，要使用精确、量程适合的移液枪，并且不要使Tip插入液面过深，否则会因Tip壁粘着造成损失。3．分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。●操作方法：反转录反应（参考“附录.RNA样品的制备”）【SYBR®Green分析法】1.按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性,减少分装时造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。试剂使用量终浓度5×PrimeScriptBuffer（forRealTime）2μl1×PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μlOligodTPrimer（50μM）*10.5μl25pmolRandom6mers（100μM）*10.5μl50pmolTotalRNARNaseFreedH2Oupto10μl*2*1Random6mers和OligodTPrimer同时使用，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。使用单引物进行反转录时，使用量分别如下：Random6mers（100μM）0.5μl（50pmol）OligodTPrimer（50μM）0.5μl（25pmol）SpecificPrimer（2μM）0.5μl（1pmol）*2反应体系可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用500ng的TotalRNA。2.反转录反应条件如下:37℃15min*3（反转录反应）85℃5sec（反转录酶的失活反应）4℃*3应用GeneSpecificPrimer时，建议反转录反应条件设置为42℃15min。PCR反应有非特异性扩增时，将温度升到50℃会有所改善。注意：将得到的RT反应液加入到下一步的RealTimePCR反应体系中，其加入量不要超过RealTimePCR反应体积的1/10（V/V）量。反转录反应体系不建议使用【TaqMan®探针分析法】用的操作方法，因进行RealTimePCR时SYBR®Green的背景可能会过高。【TaqMan®探针分析法】1.按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性,减少分装时造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。-2-试剂使用量终浓度5×PrimeScriptBuffer（forRealTime）2μl1×PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μlOligodTPrimer（50μM）*10.5μl25pmolRandom6mers（100μM）*12μl200pmolTotalRNARNaseFreedH2Oupto10μl*2*1Random6mers和OligodTPrimer同时使用，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。使用单引物进行反转录时，使用量分别如下：Random6mers（100μM）2.0μl（200pmol）OligodTPrimer（50μM）0.5μl（25pmol）SpecificPrimer（2μM）0.5μl（1pmol）*2反应体系可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用1μg的TotalRNA。2.反转录反应条件如下:37℃15min*3（反转录反应）85℃5sec（反转录酶的失活反应）4℃*3应用GeneSpecificPrimer时，建议反转录反应条件设置为42℃15min。PCR反应有非特异性扩增时，将温度升到50℃会有所改善。注意：将得到的RT反应液加入到下一步的RealTimePCR反应体系中，其加入量不要超过RealTimePCR反应体积的1/10（V/V）量。反转录反应体系也可以使用【SYBR®Green分析法】用的操作方法，此时，10μl反应体系可最大使用500ng的TotalRNA。●操作方法：RealTimePCR反应以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR®PremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（CodeNo.RR820A）进行RealTimePCR反应的操作方法。采用TaqMan®探针法进行检测时，请选择PremixExTaq（ProbeqPCR）（CodeNo.RR390A）。◆应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystemII扩增仪的操作方法1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)（2×）12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）1.0μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）1.0μl0.4μM*1RT反应液（cDNA溶液）*22μldH2O（灭菌蒸馏水）8.5μlTotal25μl*3*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。*2建议在25μl反应液中使用相当于10pg～100ngTotalRNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。*3建议反应体积为25μl。-3-2.进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。当使用Tm值较低的引物或两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Repeat：195℃30秒Stage2：PCR反应Repeat：4095℃5秒60℃30秒Dissociation◆特别提示：本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。3.实验结果分析。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。◆应用AppliedBiosystems7300/7500/7500FastReal-TimePCRSystem和StepOnePlus™Real-TimePCRSystem的操作方法1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量使用量终浓度SYBR®PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)（2×）10μl25μl1×PCRForwardPrimer（10μM）*10.8μl2μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）*10.8μl2μl0.4μM*1ROXReferenceDyeorDyeII（50×）*20.4μl1μlμl1×RT反应液（cDNA溶液）*32μl4μldH2O（灭菌蒸馏水）6μl16μlTotal20μl*450μl*4*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。*2ROXReferenceDyeII（50×）比ROXReferenceDye（50×）浓度低，使用7500Real-TimePCRSystem和7500FastReal-TimePCRSystem时，请使用ROXReferenceDyeII（50×）。使用AppliedBiosystem7300Real-TimePCR和SystemStepOnePlus™Real-TimePCR时，请使用ROXRe