22 色层分离法

1第二十二章色层分离法2主要内容安排1.基本概念分配系数、阻滞因数2.吸附色谱（薄层色谱、柱色谱）：基本原理、如何选择展开剂和极性、色谱操作一般流程3.分配色谱：（同吸附色谱操作类似）4.离子交换色谱：已经讲过5.凝胶色谱：已经讲过6.高效液相色谱的分离原理及应用7.蛋白质分离的常用色谱方法3色谱技术Chromatography色层法是目前广泛应用的一种分离技术，本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在色层法已成为生物工程、生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。俄国植物学家茨维特俄国植物生理学家和化学家。1872年5月14日生于意大利阿斯蒂,1919年6月26日卒于苏联沃罗涅日。1896年获日内瓦大学哲学博士学位后，全家移居俄国。1901年获喀山大学植物学学士学位。1902年任华沙大学讲师，1907年任兽医学院教授，1908年任华沙理工大学教授。4茨维特应用化学方法研究细胞生理学。1900年他在树叶中发现了两种类型的叶绿素：叶绿素a和叶绿素b，后来又发现了叶绿素c,并分离出纯的叶绿素。他最重大的贡献是发明分析化学和有机化学中极重要的实验方法——色谱法。他的第一篇关于色谱法的论文发表在1903年华沙的《生物学杂志》上。1906～1910年的论文都发表在德国的《植物学杂志》上。5在这几篇论文中，他详细地叙述了利用自己设计的色谱分析仪器，分离出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素。由于他的论文发表在不大知名的期刊上，所以当时没有引起化学界的注意。直到1931年，R.库恩才发现茨维特所发明色谱法的重要性，此法才得到普遍的推广和应用。67固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚色带色谱法是俄国植物学家茨维特1906年首创的分离植物叶色素。醇黄色胡萝卜素叶绿素1）石油醚黄色胡萝卜素2）3）叶绿素易溶于石油醚暗绿色9Tsweet用滤纸做推广0.1%乙醇+醚黄色胡萝卜素叶绿素蒸干暗绿色加石油醚和滤纸滤纸与叶子一样，即只有叶绿素保留下来醚+醇＋滤纸纸无色10Tswett结论很可能是植物组织的分子力干扰，即由于吸附，石油醚对色素的溶解力小于植物组织的吸附力，而这种吸附力能被某些其它溶剂如乙醇客服，因此即使石油醚中加入少量无水乙醇也能将所有的色素提取出来色谱技术（分配色谱）概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。1112层析分离法常用的层析技术有四、五十种。特点：1.分离效率高，能分离性质很相似的物质2.既可以做分析检测用，也可以用来制备分离3.操作规模小，纯化倍数高，放大困难4.适用于高价值产品最终产品纯化13层析分离分类（1）按溶质分子与固定相相互作用机理（我们的重点）吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）凝胶过滤（分子大小与形状）离子交换实验技术分类低压（小于0.5Mpa)中压(0.5-5Mpa)高压(5-40Mpa)电泳(溶质在电场中移动）14按照分离的样品多少分类⑴分析色谱（10mg）⑵半制备色谱(10-50mg)⑶制备色谱(0.1-1g)⑷工业生产规模色谱(20g/d)年产10g合格的重组人粒细胞集落刺激因子（rhGcs-F），其产值高达1亿元。层析分离分类（2）15层析分离分类（3）根据固定相形状分类柱层析纸层析薄层层析根据流动相分类气相层析液相层析超临界流体层析按操作方式分类（展开）迎头法（frontalanalysis)顶替法（displacementanalysis)洗脱分析（elutionanalysis)16色层分离法基本原理17分子筛层析示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：18基本概念1.固定相：可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆吸附、分配等。2.流动相推动固定相上待分离的物质朝一个方向移动的液体、气体或超临界流体等。193分配系数分配系数：溶质在二液相之间的平衡关系吸附色谱：溶液与固体接触时，Langmuir方程，低浓度为直线凝胶色谱分配系数表示凝胶颗粒内部水分中溶质分子所能达到的部分，用一定的凝胶，分离一定的溶质时，也为常数。总结：当浓度低时候，固定相浓度和流动相浓度都成线性关系。cqKdbcacq14、溶质在吸附柱（纸或板）行为解离常数kp分离因数α阻滞因数Rf洗脱容积Ve20214.1解离常数和分离因数）mt-结合溶质分子的有效位子总浓度m-空余的有效结合位子浓度q-溶质在固相的浓度c-溶质在液相的浓度解离常数溶液C已吸附q空余的的有效结合位置浓度m应用22)1()()1(,,mttttpttttttmcqcmqmckcqcccqmCm位置大大过剩的情况下（低浓度）比较，有效度时，即与溶质分子的浓远远大于当α容易测量,ct和mt也能测定23的移动距离前缘在同一时间内溶剂溶质的移动距离移动速度流动相在层析系统中的溶质的移动速度)(fRsdmAKAVV积能进行分配的有效截面溶质移动距离Rf=sdmmAKAA4.3阻滞因数Am—流动相的平均截面积As---固定相的平均截面积流动相的移动距离＝V/Am其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小244.4洗脱容积Ve在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相的体积5理论塔板•反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系•理论塔板数的计算方法：•N---理论塔板数tR---保留时间•W1/2---半峰宽Wb---峰底宽度•理论塔板高度：L---柱长2522/1)(54.5WtNR2)(16bRWtNNLH266分辨率•也称为分离度，一般指相邻二峰的分开程度。•Rs＝1，二组分得到较好的分离，互相沾染约2%，即每种组分纯度约98%。•Rs=1.5二组分基本分开，每种组分的纯度达到99.8%)(22112WWttsRRR2728第二部分色谱分离第一单元吸附色谱分离吸附色谱•原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离•关键要素：吸附剂和展开剂的选择•吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH229Adsorptionchromatography3031一层析介质层析介质种类无机（氧化铝，硅胶，活性碳）有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺等）321.氧化铝一种多孔性、高分散度固体•（1）有很大的比表面积，其微孔表面具有吸附性能。•（2）分子式Al2O3简单，空间形态复杂，8种以上的形态•（3）同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径分布、比表面积等存在差异（4）吸附量与含水量关系很大制备：由氢氧化铝加热脱水得到的。吸附基团：铝离子种类：•碱性：由氢氧化铝高温脱水，用于碱性稳定的溶质•酸性：碱性氧化铝经盐酸洗涤，用于在酸性稳定的溶质•中性：碱性氧化铝经水洗后活化制得应用：有机溶剂中分离天然成分332.硅胶•硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质•（1）化学组成SiO2.XH20，•（2）属于无定形结构，基本结构质点为Si—O四面体，相互堆积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。•（3）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。•硅胶的分类（常以孔径大小来分），•(1)特细孔硅胶(0.8nm以下)。•(2)细孔硅胶（1.5—2.0nm)•(3)中孔硅胶(4.0一5.0nm)•(4)粗孔硅胶(10.nm以上)•应用：吸附层析剂与分配层析剂优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，用于天然产物分离34柱层析硅胶：白色粉末状颗粒，主要成分为二氧化硅。无毒，无色无味，且不溶于水和有机溶剂。具有高比表面和一定的孔结构，有较强的吸附性能，易吸潮。柱层层析硅胶主要用于石油产品精制，脱除芳烃物质或用于中草药有效成分的分离提纯，高纯物质的制备等。也可做催化剂载体，废油中杂质滤除35柱层析硅胶36薄层层析硅胶板37薄层色谱1）展开剂系统溶剂的选择一般由实验确定。溶剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大，Rf增加。可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果组分的展开涉及吸附剂、被分离化合物和溶剂三者的竞争，情况复杂，经验为主展开剂选择的原则：（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力3839极性强弱与介电常数有关。介电常数越大，极性愈强。常用溶剂按照极性从大到小的顺序排列大概为：水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳环己烷石油醚402）显色1.碘蒸汽显色2.紫外线显色3.专属显色剂41一般吸附柱色谱操作流程根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物吸附色谱（adsorptionchromatography）应用：对于极性，结构异构体分离和脂肪族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。4243444546量大点单一的样47量少点单一的样分配色谱原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法要素：固定相、载体、流动相48载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：–硅胶–硅藻土–纤维素–葡聚糖凝胶49固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱）*反相色谱固定相是非极性的,流动相是极性的50疑问硅胶材料是吸附色谱还是分配色谱?51硅胶吸附色谱通常所讲的硅胶柱色谱是指硅胶吸附色谱，其分离原理在于依据待分离化合物与硅胶表面的硅醇基的吸附力不同，从而实现化合物的分离。52分配色谱分配，就要存在两种互不相溶的溶剂系统.极性大的溶剂系统吸附在硅胶(支持剂)上，分离过程中不移动，称为为固定相;极性小的溶剂系统作为洗脱剂，分离过程中从柱子上慢慢移动下来，称为流动相。在整个分离过程中，待分离化合物不断地在固定相和流动相之间反复分配，从而实现分离。5354三凝胶过滤色谱gelfiltrationchromatography,GFC凝胶色谱也叫凝胶扩散色谱、排阻色谱或限制扩散色谱等。基本原理：将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于流经体积的差异，使不同相对分子量的组分得以分离的色谱方法。凝胶内部水分起固定相作用，外部水分起流动相作用5556575859://特点操作简单分离介质不需再生即可重复使用分离效果好重复性高样品回收率高，接近100%。分离条件缓和凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，对生物活性无影响应用广泛，分离的相对分子量范围很宽分辨率不高、操作较慢（因为相对分子量差异表现在流速差异上，流速必须严格控制。）、对样品黏度不宜太高。63凝胶的结构和性质641.葡聚糖系列1.SephadexG系列2.SephadexLH-20系列2.琼脂糖系列1.普通系列Sepharose2B等2.架桥琼脂糖凝胶SepharoseCL系列3.其它系列：高分辨率系列（H.P）快流速系