组织切片技术

石蜡切片及H&E染色技术石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。现以石蜡切片为例，介绍切片标本的制备方法。组织学制片步骤：取材固定冲洗脱水透明浸蜡包埋修块切片贴片烤片染色封片观察结果根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，动物组织取材要稍大，植物组织取材稍小。取材动物组织标本的取材动物的处死方式一般为活杀，组织标本来源较新鲜，10min内即可完成固定和冷冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。制片所需的材料要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要从活的动物体上采取材料，在一般情况下，要对动物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。所用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。组织取材注意事项1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学研究。动物放血处死后立即取材，最好在心脏还在跳动时立即取材，马上投入固定液中；2.注意防止人为因素的影响切取组织的刀剪必须锋利，刀要足够长。切分组织块时，不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压。以免损伤组织；取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。3.组织块的大小厚为0.2～0.5cm，大小可根据需要而定。柔软组织不易切小,可先取稍大的组织块固定2～3h，等组织稍硬后再切成薄的小块继续固定。4.取材应注意清洁，组织块上如有血液、污物和粘液沾着，应用生理盐水洗涤后再入固定液。5.取材时间：原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。6.注意确定取材部位和包埋切面的方向，选好组织块的切面应熟悉器官组织的结构并据此决定其切面的走向，7.组织清除：切除(清除)不需要的部分，特别是组织周围的脂肪，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。8.明确编号，登记新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组织块后，应立即采用一种方法，将组织尽可能保持原有的形态结构，且有利于保存和适于制片的操作，这一步骤称为固定。化学固定法就是用化学试剂配制成固定液使组织固定。固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣，除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。2.2组织标本的固定①防止组织自溶和腐败；②使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构；③因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色；④固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作。固定的目的和作用在于：（1）小块组织固定：从人体或动物取出组织，切成小块投入固定液中固定。（2）局部注射固定：某些组织和器官其固定液不易渗透或渗透较慢，渗透不均匀，还有些器官为保持外型或卷缩，可采取局部注射固定方法，固定4～6小时后，再将组织切成小块继续投入固定液中固定。（3）整体注射固定：此法主要用于科研和大体解剖，亦可用于组织学教学制片。固定的方法固定液的种类很多。可分为两大类：单纯固定液和混合固定液。单纯固定液：是用一种化学试剂作为固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它们只是对细胞的某种成分固定得较好；不能将细胞所有的成分都保存下来。如升汞固定蛋白质、冰醋酸固定核蛋白、无水乙醇可固定糖原等，单纯固定液有一定局限性。混合固定液：是用几种化学试剂，按一定的比例混合配制而成的，由于各种试剂的优缺点互相弥补，因此可产生较好的效果。固定液的选择（1）甲醛固定液：是一种还原剂，呈酸性，原液浓度为37%～40%，配成固定液的浓度为4%，习惯上称为10%，配制时取甲醛原液10ml，加蒸馏水（D.W）或缓冲液至100ml，为甲醛固定液（10％福尔马林）。甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，pH为7.6，能长期保持中性。甲醛固定后，通常需在流水中冲洗24-48小时,否则影响染色效果。(2)4％多聚甲醛固定液最好是动物经灌注固定取材后，继续固定2-24h。该固定剂较为温和，适用于组织标本的长期保存。(3)Bouin’S液苦味酸饱和水溶液75ml甲醛25ml冰醋酸5ml是常用的良好固定液，渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，不使组织变硬变脆，保持结构完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定为12～24小时，但固定过久，对碱性染料着色不利。（4）Carnoy氏液纯酒精60ml氯仿30ml冰醋酸10ml此固定液渗透速度快，2mm以下小块组织固定时间2～4小时，它是细胞极好的固定液，适合于细胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入纯酒精脱水。(5)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(6)Methacarn固定液甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备用，对核内抗原的保存效果较好。(7)丙酮及醇类固定剂丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是对蛋白质的沉淀而发生固定作用。酒精是一种还愿剂，用于组织固定以95%的浓度为宜，酒精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元的固定。甲醇、丙酮常用于细胞固定。注意事项：1.根据材料的性质和制片的目的选择固定液。2.一般固定液都以新配为好，有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合。配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。3.固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20-30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次固定液。4.材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，以免相互混淆。5.标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。水洗1．目的：洗去渗入组织中的固定液，终止固定。以免影响对组织内结构的观察、分析和研究。2．原则和方法：固定后的组织块的冲洗，一般情况下是置水龙头下以自来水流水冲洗，这样可以使组织中的固定液随时溢出，洗得更干净彻底，有些还需要进行特殊的洗涤。（1）各种以水配制的固定液如甲醛，都必须用流水冲洗，大块组织一般冲洗24小时，小块组织一般冲洗2—10小时。（2）固定液为多聚甲醛时，用于免疫组织化学等特殊染色的应将组织投入PB缓冲液中，每60分钟更新洗涤液一次，累计6小时。（3）固定液为酒精或是酒精混合液，一般不需用水冲洗，其组织块的洗涤应用与固定液浓度相等垢酒精换洗或者直接进行脱水的程序。（4）用锇酸或含有锇酸的固定液固定的组织，必须用流水彻底冲洗干净。（5）经含有苦味酸的固定液固定的组织块，无论其固定液是水溶性还是酒精溶性，都应充分冲洗，水溶性固定液固定的组织块一般须冲洗12小时，再进入70%的酒精溶液洗涤，酒精溶性固定液固定的组织块直接进入70%的酒精溶液洗涤，该溶液可以脱掉苦味酸的黄色，但最好从50%酒精开始洗涤。（6）冲洗好的组织可存放在75%酒精内修块厚度2-3mmX15mmX15mm。修块的目的是为了后面的包埋，特别要注意切向和切面问题，切面要平整，以方便在包埋时能立在纸盒中。一定要至少保留将来的切片中至少能见到有一面为组织器官的被摸面，其他面如需要修整，最好取直角，方便展片组织脱水、透明脱水(Dehydration):由于石蜡不溶于水，因而，组织经固定和水洗后含大量水分，需先用乙醇类试剂进行脱水。脱水是用一种既能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。如用浓度逐渐升高的酒精(70-100%)将组织中的水完全置换出来。现最常采用的脱水剂是乙醇，进行梯度脱水，此外，丙酮、正丁醇、松脂醇等也可作为脱水剂。脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。脱水的过程：50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100%→100%乙醇脱水应逐步进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。程序：50%酒精（1h）→70%酒精（1h或过夜）→80%酒精（1h）→95%酒精I（0.5-1h）→95%酒精II（0.5h）→纯酒精I(30min)→纯酒精II(20min)注意事项：1.在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。2.在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。无水乙醇吸水能力太强，容易造成组织块的过度硬化，使得切片理组织易碎裂。3.每次更换新的脱水剂时（组织块从低浓度到高浓度），都要把组织块放在吸水纸上吸干，装组织块的容器也要控干水分，以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水效果。4.如需过夜，应停留在70%酒精中。5.脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象透明（Clearing）:脱水后，组织内含有大量的乙醇。由于石蜡不溶于水，也不溶于醇类试剂。因此，必须用一种既能与乙醇又能与包埋介质互溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为最终的包埋创造一个有利的条件，该过程即透明。现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定程序：纯酒精-二甲苯（1：1）（20min）→二甲苯I(10-20min)→二甲苯II(10-20min)注意：透明时间一般取短（10min），以组织块刚透明为宜。注意事项：1.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。2.更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。3.在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。浸蜡（Infiltration）:目的：除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。方法：将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用液态石蜡完全置换出组织块中的透明剂，最后，组织细胞内被大量石蜡支撑，室温时石蜡凝固成固态，使组织能用于石蜡切片。2.4浸蜡（2）浸蜡的步骤在60度恒温蜡箱中放置3个蜡杯，分别编号1（52℃~54℃）、2（52℃~54℃，或54℃~56℃）、3（56℃~58℃），其中分别盛软蜡、软蜡、硬蜡，取透明好的组织块放入软蜡中各1小时，迅速取出放入硬蜡，同样放置1小时。如果时间来及包埋，可以将已经完成浸蜡的组织块取出放在温箱外，第二天继续。程序：石蜡(52-58℃)I(30min)→石蜡(52-58℃)II(30min)→石蜡(52-58℃)III(30min)注意：（1）温箱温度一般高于蜡的熔点5℃，设定在65-70℃。（2）蜡必须提前加热融化后，放入温箱内保温平衡2-4h。（3）尽量将透明的二甲苯控净。注意事项：1.尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能超过60℃；浸蜡时间不宜过长。浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆变。2.操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。3.透蜡时间根据组织的薄厚、大小来进行。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。①水和酒精可以相溶。②酒精和二甲苯相溶。③二甲苯和石蜡可以相溶。因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能