激光扫描共聚焦显微镜技术及应用

激光扫描共聚焦显微镜技术及应用ThetechniquesandapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy新疆地方与民族高发病重点实验室曹薇薇1.原理2.在生物医学中的应用3.样品要求激光扫描共聚焦显微镜技术及应用激光共聚焦扫描显微镜基本配置LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制装置Computer计算机Microscope荧光显微镜Anti-vibrationtable防震台Confocalscananddetectorunit共聚焦扫描及检测装置ZEISSLSM510METAConfocalSystem激光共聚焦扫描显微镜基本原理激光共聚焦扫描显微镜基本原理普通光学显微镜和共聚焦显微镜的比较增加的部件•扫描模块•电子控制器•激光模块激光扫描共聚焦显微镜普通广视野光学显微镜图像采集并行，一次一幅串行，逐个像素的照明区域广视野点照明光源卤素灯或汞灯激光检测器眼睛或CCD照相机单通道光电倍增管多色多通道光电倍增管信号分离分色镜，吸收滤光片分色镜组，吸收滤光片反射光栅（新）非共聚焦/共聚焦图像广视野共聚焦非共聚焦/共聚焦图像激光共聚焦显微镜在同一时刻对样品中的一点成像这一点的像在屏幕上显示为一个像素为获得样品的二维图像，激发光的聚焦点必须在样品上移动从点到二维图像•扫描镜驱动激发光束以线的方式移动•扫描过程中得到的像素构成最终的二维图像聚焦光锥样品X/Y图像XY•通过激发光的水平移动（X/Y），得到样品中某一特定层面的二维图像•这一层面代表了样品中的一个光学切片•无物理接触的采集•要获得样品的三维信息，激发光聚焦点不仅要在XY方向上移动，还要在Z方向上移动•通常，在扫描一个XY平面后，通过载物台的垂直移动使激发光聚焦点在Z方向上移动•结果是一个三维数据序列，包含着若干幅代表样品中不同光学切片的XY图像X/Y/Z序列Z轴驱动从点到三维图像•普通广视野荧光图像•样品的厚度大于物镜的焦深扩展焦深•共聚焦显微镜获得的样品的光学切片•光学切片的厚度取决于共聚焦针孔的直径一系列取自不同光学层面的的共聚焦图像，包含着整个样品的图像信息扩展焦深时间序列时间序列记录（真实时间）在线比率内/外触发（4内4外）荧光漂白程序事件标记像素时间感兴趣区域/线的荧光强度平均值（在线或离线）最大时间分辨率：幅：5fpsby512x512或77fpsby512x32线（512像素）：~2600/sec.(0.38ms)速度级别：13X2MultifluorescenceimagingMultifluorescenceimagingapproachesareideallysuitedtodirectlyvisualizerelationshipsorinteractionsofmoleculesandothercellcomponentsintheirnaturalcontext.UsemultiplemarkerssimultaneouslyFITC/Rhodamine双标记：同时激发和检测这两种染料时，一部分FITC的发射光进入了Rhodamine的检测通道（发射串扰）多重荧光成像——串扰问题bovineendothelialcells同时的扫描FITCRhodmerged分步的多重扫描FITCRhodmerged串扰问题的解决方法之一——多重扫描（Multitracking）这个问题可以通过按顺序分别激发和检测两种染料来解决先决条件是：用于激发FITC的激发光波长对Rhodamine没有激发（无激发串扰）1.原理2.在生物医学中的应用3.样品要求激光扫描共聚焦显微镜技术及应用confocal在生物医学领域中的应用只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察活细胞动态荧光测量：检测细胞内Ca++、K+、H+等离子的动态分布及动态定量；形态学研究：细胞结构、细胞骨架、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡，以及寄生虫和微生物表面和内部结构；中枢神经系的F联系、肿瘤细胞分类……分子生物学：原位杂交、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变、荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通，受体与配体相互作用……原理:检测游离Ca2+变化的荧光探针多为Ca2+螯合剂，通常不能透过细胞膜，只有与乙酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内,被细胞内酯酶水解后方能与胞内游离钙结合后发出荧光。1.活细胞内离子动态变化测量细胞内游离Ca2+测量荧光探针激发波长发射波长KdCalciumGreen-1507nm530nm190nMCalciumGreen-2507nm535nm550nMOregonGreen488494nm520nm20,000nMFLuo3-AM,464nm526nm390nMFurared420/480nm637nm140nM激光扫描共聚焦显微镜可对单个细胞内离子（Ca2+、K+、Na+、Mg2+、pH等）的动态变化做实时定量分析；能进行细胞生理信号的动态监测。Ca离子时间序列ThenewcolocalizationdialogScattergram,imagedisplayanddatatableareinteractivelylinkedScattergramDatatableImagedisplayTools2QuantitativeColocalizationAnalysisIntensityBeforebleachAfterbleach90minafterbleach3.荧光漂白恢复(FluorescenceRecoverafterphotobleaching;FRAP)检测细胞连接间的信息传递用GFP标记HeLa細胞的组蛋白(histone)。用FRAP来观察组蛋白的扩散速度（使用488nm激光）05010015020025030035040045017131925313743495561677379859197103FRAP4.荧光能量共振转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)——大分子构象的改变I.荧光能量共振转移:受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。供体荧光素受体荧光素1.供体与受体间的距离10nm或=1-7nm2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠II.荧光能量共振转移的条件488nm520nm650nm540nm650nm488nm520nm供体荧光素(Cy2)受体荧光素(Cy3)供体荧光素(Cy2)受体荧光素(Cy3)FITC/TRITC,Cy3/Cy5,CFP/YFPFluorescenceIntensityTime检测以供体的激发波长的光照射样品,没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光。应用受体与配体的相互作用：亚基的结合与分离大分子构象的改变LigandCy3Cy5III.常用荧光共振转移探针对Cell-FITCHelaCellTubulin(FITC+TRITC)HelaCellTubulin(FITC+TRITC)-Z-StackHEKCells-3DVolvoxZ-Stack拟南芥细胞：叶绿体，线粒体Co-localizationFITC+SytoxGreenZebrafeshEmbryoUnknown激光扫描共聚焦显微镜技术及应用1.原理2.在生物医学中的应用3.样品要求标本：1.经荧光探针标记(单标、双标、三标）2.固定的或活的组织3.固定的或活的贴壁培养细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上4.悬浮细胞，涂片或滴片后，用盖玻片封片样品制备要求样品制备要求载玻片、盖玻片：载玻片与盖玻片的厚度应尽可能薄，玻面光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。封裱剂：常用缓冲甘油封固。需无自发荧光，无色透明。由于甘油的荧光亮度在pH为8.5～9.5时较亮，不易很快褪去，故常用甘油和0.5MpH为9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。荧光探针的选择：实验标本要求经过荧光染色后，才能进行激光扫描共聚焦显微镜观察和分析。应根据实验的要求选择合适的荧光探针，探针的选择应具有高灵敏度和高度的特异性。观察多重荧光标记时。应注意荧光的发射带是否重叠。同时还应注意实验标本的自发荧光与所测荧光信号的区分。样品制备要求激光共聚焦开放时间：周二全天，需提前3-5天预约地点：医学院主楼二楼203室联系电话：2057882，13319935801联系人：曹薇薇