微生物限度检查法

微生物限度检查法1．微生物限度检查法概述2．我国药品微生物限度标准的发展情况3．我国药品微生物限度检验方法的发展情况4．微生物限度检查法所需的材料5．微生物限度检查试验用物品的准备6．无菌室技术要求7．细菌、霉菌与酵母菌的检查方法供试品的抽样、保存及检验量试验操作前的准备供试液的制备对照用菌液的制备菌数测定阴性对照试验细菌、霉菌（酵母菌）检验程序供试液的稀释（10倍递增稀释法）注平皿倾注培养基培养菌落计数菌数报告规则注意事项8.细菌、霉菌（酵母菌）的其他检查方法①管稀释法（试管法、MPN法）②滤膜法③计数板法④仪器法⑤平板涂布法①表面涂抹平板法②滤膜培养法③酵母菌镜检计数法9.大肠杆菌检查法概述、原理检验程序增菌培养分离培养纯培养、革兰染色、镜检生化试验（IMViC）实验中的注意事项10．沙门菌检查法11．铜绿假单胞菌检查法12．金黄色葡萄球菌检查法13．破伤风梭菌检查法14．活螨检查法15．结果判断1．微生物限度检查法的意义药品是防病治病、关系用药者生命健康的特殊商品，必须保证其质量，用药的安全与有效。微生物污染药品引起的药源性疾病屡见不鲜，在国内外均有报道。为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。其意义在于：已有许多实例表明，药品污染微生物不仅危及病人用药安全，而且也直接影响药品的有效性，所以药品卫生质量是药品质量不可分割的部分。反映药品生产工艺的科学性、合理性及质量管理水平。通过检验，凡工艺条件、生产管理水平、生产人员的素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品，染菌必然严重，不合格率无疑就高。微生物限度的检验是提供药品卫生质量状况的重要依据，因而保证销售与使用过程中药品的有效性与安全性，是促进与提高生产单位全面质量管理水平与提高药品质量的重要依据。微生物限度检查法概述2．微生物限度检查的范围根据药品使用的要求，可划分为两大类：规定灭菌的药品：包括注射剂和输液剂，及用于体腔、严重烧伤、溃疡、出血及眼科用药等制剂。非规定灭菌药品：包括常用的口服制剂与一般外用制剂。对这一部分制剂一般不要求绝对无菌，允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有可疑致病的细菌存在。由于致病菌的范围很广，各国药典都规定了几个常见的致病菌或指标菌作为控制菌。在非规定灭菌的制剂中，对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定：染菌量检查：包括细菌数、霉菌数及酵母菌数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度。控制菌检查：包括大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的检查等。3．药品微生物限度检查抽样量与检验量药品微生物限度检验中的困难，最根本的原因在于检验对象本身的特殊性。药品微生物限度检验对象的特性：不确定性：药品受外来微生物的污染，这种污染是可无可有；在有中又可多可少；其种类可以多样。污染的情况可依生产、设备、原材料、管理、剂型等条件而定，非药品本身所固有。所以微生物限度检查的对象是不确定的。药品所规定的检查项目，除无菌检查、热原检查具有上述性质，其他项均无此特征。这一点往往被忽视。污染对药品而言是一个意外事件。污染批号中的不合格品是一个随机变量。分布的不均匀性：不均匀性是不确定性的另一种表现形式，在一个批号内产品有的被污染，有的不被污染，分布不匀；在被污染的部分中有的数量极多，有的较少，种类上可以复杂或较单一。这种不均匀性源于污染源的复杂性；原辅料污染、工艺污染、空间污染和操作人员污染等等构成污染量的多少差异，形成不均态。再者，微生物具有簇团性；簇团大小、紧密程度是可遗传的，簇团的分散性差异极大，该特点无疑强化了不均匀性。活体特征：药典中以活的微生物作为检验对象也是独特特性。由于以上特殊性，抽样对微生物限度检测值将产生很大的影响。当药品无污染时，抽样将不影响检验，当批产品存在污染品时，抽样的样本是随机变量，抽样的影响如下：抽样方法：不同的抽样方法对批产品总体的代表性是不同的，测定值也是有差异的。如抽取可疑样品与随机抽样，其检出率与数字显然前者大于后者。抽样量：抽样量的多少，对样本的代表性极为重要，如含10％不合格率的批产品，从中抽取2件数为样本进行控制菌检验时，有81％机率判定为合格品，而抽取30件数时，会有96％机率判定为不合格品。以上表明抽样方法、抽样数量、抽样次数均影响测定结果。以控制菌检验为例，决定染菌检出与否必须具备两个条件：（A）样品是否是含染菌的样品；（B）检验操作正确无误，其中（A）是前提条件。中国药典2000年版关于抽验方法与抽样数量规定：供试品为随机抽样，一般抽样量为检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量。对异常的供试品应针对性的抽样，对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原样品。对异常的供试品应针对性的抽样，对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原样品。凡能从药品、瓶（外盖内侧及瓶口周围）外观看出发霉、生虫以及变质的药品不必再继续检验，应直接判为不合格。不能以有时外观有上述情况而检验内容为合格，来判定该药品合格，因为瓶口染菌，对服用者是不安全的，如自瓶口直接服药时，所染菌随之进入人体，同时发现瓶口一旦染菌，瓶内药液最终要受到污染。检验量与抽样量是两种不同范畴的量，后者指从全批产品（或抽样全过程）抽取的单位包装，前者是指检验用量，一般抽样量大于检验量。检验量只是抽样量各包装的混合样品的一部分。中国药典2000年版规定检验量为每次最少应分取两瓶（盒）以上的样品共10克或10毫升，中药蜜丸至少应分取4丸以上共10克。目前我国以1克或1毫升、膜剂以10cm2作为报告单位；英美药典及欧洲药典也是以1克或1毫升作为限量，但控制菌有的是以10克或10毫升作为限量，比我国的限量规定严格。总之，抽样量和检验量大小对检验结果影响较大（尽管目前抽样方案还存在不科学，漏检率高）。由于药品微生物检验是破坏性检验，检验1瓶（盒）会破坏1瓶（盒），检验量愈大，则破坏性愈大，尤其对贵重药品，生产单位、经营单位损失也就越大。因此，如何确定适宜的既能满足抽样检验基本要求，又能使生产、经营者可接受的抽样方案，是目前需要解决的问题。但目前的规定必须遵循，不能随意变动，尤其不能减少（除对贵重、微量包装的药品可酌情减少检验量除外）。微生物限度检验方法的发展情况1．1980年我国药品微生物限度检验工作正式发行《药品卫生检验方法》。2．1984年出版第二版《药品卫生检验方法》。3．1990.12年中检所出版第三版，主要对原《方法》中各地反映意见较多的问题进行了改写；增加了部分检验方法和供试液的制备方法；为了同国内外检验方法相协调，对某些内容作了相应的更改，此外，还参照国家标准的编写格式作了编排。4．1990年版药典第二增补本收载了微生物限度检查法。这也是我国首次在药典上收载此方法。5．1995年版药典也收载了此检查法，少数剂型收载了限度规定。（20个化学药品规定限度）。6、2000年版药典一、二部同时收载了检查法和限度标准。首次把微生物限度检查法和限度标准同时发布。微生物限度标准发展情况1．1972年开展此项工作2．1978年颁布我国第一个“药品卫生标准”3．1986年颁布修改后的“药品卫生标准”，1987年12月1日起供内部执行4．1989年下达“药品卫生标准补充规定和说明”5．1990年版药典第二增补本收载了20个化学药品种的微生物限度标准规定，与国际惯例一致6．1995年版药典少数几个剂型（滴眼剂等）收载了微生物限度。规定按微生物限度检查法检查不得有菌生长7．2000年版药典按剂型、中西药分类规定微生物限度，还对几个生化药品在各论中项下作了具体规定实验所用的培养基营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）胆盐乳糖培养基（BL）4－甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基（MUG）乳糖培养基5％乳糖培养基蛋白胨水培养基磷酸盐葡萄糖胨水培养基枸橼酸盐培养基曙红亚甲蓝琼脂（EMB）麦康凯琼脂（MacC）营养肉汤微生物限度检查常用检验设备及器材恒温培养箱30～35℃36±1℃霉菌培养箱25～28℃恒温水浴箱45±1℃净化工作台生物显微镜1500X体视显微镜或放大镜电冰箱电热干燥箱250～300℃高压蒸汽消毒器电子天平或药物天平感量0.1g匀浆仪或研钵锥形瓶100ml，250ml，500ml，1000ml直形吸管1ml，10ml量杯10ml试管18x180mm，13x200mm，30x200mm试管筒培养皿9cm培养皿筒陶瓦盖12cm量筒100ml，500ml，1000ml滤器及微孔滤膜孔径0.45±0.02um注射器1ml，5ml，10ml，30ml载玻片及盖玻片接种针及接种环试管架乙醇灯康氏振荡器离心机500～4000／min紫外灯365nm玻璃或搪瓷消毒缸（带盖）大、小橡皮乳头乙醇棉球或碘伏棉球灭菌剪刀、镊子、钢锥灭菌称样纸灭菌不锈钢药匙火柴、记号笔（玻璃铅笔）白瓷盘、洗手盆实验记录纸细菌、霉菌与酵母菌的检查方法（平皿菌落计数法）（一）供试品的抽样、保存及检验量1．供试品应随机抽样。一般抽样量（2个以上最小包装单位）为检验量的3倍量。2．对异常的供试品应针对性的抽样。抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）、外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需在抽样检验。不能以外观有上述情况而检查内容物合格，来判断该药品合格。3．供试品收检后应及时检验，若有困难，应存放在该品种规定的储存条件下（一般为阴凉干燥处），勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死、损伤或繁殖。4．供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。5．供试品的取样必须在净化条件下无菌操作，严防再污染。（原料药、装量大的药）6．有剂型检验量均需取自2个以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，除需取自2个以上包装外，还应取4丸、片以上样品）。7．固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10克。8．液体制剂检验量为10毫升。9．膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为30～50cm2，化学膜剂及生化药膜剂检验量为100cm2。10．贵重的或微量包装的供试品检验量可以酌减，除另有规定外，口服固体制剂不低于3克，液体制剂采用原液者不得少于6毫升，采用供试液者不得少于3毫升，外用药品不得少于5克6（二）实验操作前的准备1．将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、研钵、吸管（1ml10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次实验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸、布）取掉。另外还有增菌液、培养基（营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基，保持在45℃左右的水浴中）、MUG培养基试管等……………..湿热灭菌的物品称量纸、手术镊子、剪子等…………………………...干热灭菌的物品2．开启无菌室紫外杀菌灯和空气净化装置，并使其工作不少于30分钟。3．操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1％苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩。4．操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。（三）供试液的制备（1：10供试液）按供试品的理化特性与生物学特性采取适宜的方法制备供试液。不得改变污染微生物的数量和种类。1．液体供试品取供试品10ml，加入到稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。（有的书上讲取10ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，摇匀）。①油剂可加适量聚山梨酯－80；②气雾剂、喷雾剂供试品将供试品置冰室内2hr后，取出，用灭菌钢锥小心钻孔，使抛射剂缓慢释放，然后用灭菌注射器加入稀释剂，混匀后吸取相当于10g或10ml供试品，再稀释成1：10供试液。USPXXIV规定是抛射剂导出后，吸取10ml或取10g供试品，加稀释液使成100ml。③合剂（系指含蜂蜜或王浆者）与滴眼剂可用供试品作为供试液。（滴眼剂不