第二章 培养基灭菌

第二章培养基灭菌杂菌污的危害：①、基质或产物消耗，产率下降；②、产物提取困难，收率低，产品质量下降；③、分解产物，生产失败；④、改变反应介质pH值，使生化反应异常；⑤、噬菌体污染，菌体裂解，生产失败等。保证纯种培养的具体措施：①、设备灭菌并确保无泄漏；②、培养基灭菌；③、通入气体(如空气)先除菌；④、确保纯种；⑤、补料应经灭菌常用方法：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌。第一节灭菌方法机理：使微生物中Pr、酶及核酸发生反应。常用化学药剂:甲醛、氯(或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐(如新洁尔灭)、臭氧等。不适于培养基。但染菌后的培养基可以用化学药剂处理。一、化学灭菌1、紫外线：波长(2.1～3.1)×10-7m有灭菌作用，最常用2.537×10-7m。但穿透力低，仅用于表面消毒和空气消毒。2、X射线：(0.06～1.4)×10-10m。3、γ-射线：由Co60产生。4、微波灭菌：5、脉冲电压：二、射线灭菌三、干热灭菌160oC、1h。不如湿热灭菌有效。其Q10为2～3，湿热灭菌对耐热芽孢可达8～10，对营养细胞则更高。Q10：温度升高10oC，灭菌常数增加的倍数。适于一些要求保持干燥的器具和材料。四、湿热灭菌湿热灭菌：利用饱和水蒸气进行灭菌。蒸汽穿透力强、放出大量冷凝热，很容易使Pr凝固而杀灭微生物。蒸汽价格低廉，来源方便，灭菌效果可靠。适于：培养基、发酵设备及管道、实验器材灭菌。蒸汽灭菌条件：121℃/30min。五、过滤除菌利用过滤方法截留M，达到除菌目的。适于：澄清流体。空气、热敏性培养基、某些产品采用过滤除菌。一、微生物的死亡速率与理论灭菌时间湿热灭菌时，培养基中微生物受热死亡速率与残存微生物数量成正比：第二节培养基的湿热灭菌N：培养基中活M数；τ：M受热时间，s；k：比死亡速率，s-1若开始灭菌时(τ=0)，培养基中活微生物数为N0，式(5-1)积分则得：t=kNoN-ln或N=N0e-kτ5-25-3此即：对数残留定律。N为经τ时间灭菌后培养基中活菌数。将存活率N/N0对时间τ在半对数坐标上绘图，斜率的绝对值为比死亡速率k，又称灭菌速度常数。下图为大肠杆菌不同温度下的残留曲线，K值越大，微生物越易死亡。一定温度下，比死亡速率随M种类不同而异。一般来说，细菌营养体、酵母菌、放线菌、病毒及噬菌体对热的抵抗力较弱，而细菌芽孢、霉菌孢子则较强。随着温度的变化，比死亡速率是值有很大变化。温度对k的影响遵循阿仑尼乌斯定律：Dk=Ae-RTE5-4A：系数，s-1；△E：活化能，J/mol；R：气体常数，8.314J/(mol·K)；T：绝对温度，K。阿仑尼乌斯定律各种各样的微生物，k值各不相同。计算时取耐热的芽孢杆菌的k进行计算，这时A=1.34×1036s-1，△E=2.844×105J/mol，式(5-4)可写作：+-=Tk14845lg36.1275-5式(5-5)：k只随灭菌温度变化。理论灭菌时间：NsNokln1=t5-6Ns：灭菌结束时培养基中活M数，取0.001个，即灭菌失败概率为千分之一；N0：为灭菌开始时培养基中活M数，取每毫升(1～2)×107个。式(5-6)是理论灭菌时间，实际设计和操作计算时可作适当比例的延长或缩短。培养基中热敏性物质会因受热而破坏。如，糖溶液焦化变色、Pr性、维生素失活、醛糖与氨基化合物反应、不饱和醛聚合、一些化合物发生水解等等。培养基成分的受热破坏也可看做一级反应：c：热敏性物质浓度；kd：分解速率常数，s-1。=-dtdcKdc5-7热灭菌对营养物质的破坏：温度对分解速率常数kd的影响遵循阿仑尼乌斯定律。由于M的△E比维生素高，因此，随灭菌温度升高，比死亡速率增加较分解速率常数快，因而高温度短时间灭菌可保留较多的营养物质。高温度短时间灭菌的理论基础：某些M受热死亡的速率不符合对数残留定律。将其N/N0对灭菌时间τ在半对数坐标中标绘得到残留曲线(图5-2)，这主要是M的芽孢在起作用。循序死亡模型：如果培养基内含有大量热敏感微生物和一些耐热微生物，则灭菌时微生物的残留曲线可能如下：二、培养基的分批灭菌概念：将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将其和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。实验室中普遍采用的灭菌锅灭菌也是分批灭菌。优缺点：工业上，培养基分批灭菌无需专门设备，设备投资少，灭菌效果可靠，灭菌用蒸汽要求低(0.2～0.3MPa表压)，但灭菌温度低、时间长而对培养基成分破坏大，操作难于自动控制。分批灭菌是中小型发酵罐常采用的一种培养基灭菌方法。（1）、分批灭菌的操作分批灭菌在发酵罐中进行。将培养基在配料罐中配制好，经专用管道泵入发酵罐，开始灭菌。通用发酵罐常见管路一般有：空气管和排气管，取样管，出料管，接种管，消沫剂管，补料管等。发酵罐夹套或蛇管，采用间壁传热而与发酵罐内部不相通。灭菌操作：进料→开搅拌→慢开夹套蒸汽阀→料液升至80℃→关闭夹套蒸汽→开3路(空气、出料、取样)进汽阀、开排气阀、包括小辫子(进料管、补料管、接种管排气阀)→升温至110℃左右→控制进出汽阀门至121℃(表压0.1MPa)保温30min→关闭过滤器排气阀、排汽阀、进汽阀→关闭夹套出水阀，开冷却水进回水阀→罐压过滤器压力→开空气进气阀引入无菌空气。随后引入冷却水，降至培养温度。(2)、分批灭菌的计算分批灭菌的过程包括升温、保温和降温三个阶段。升温：可夹套蒸汽加热，也可直接将蒸汽通入罐中，或二者兼用。但后者会因冷凝水的加入改变消后体积。保温：是灭菌的主要时段。习惯上，把保温时间看为灭菌时间。降温：灭菌后用冷却水冷却至培养温度。随着发酵罐容积的加大，升温和降温时间就延长，由此造成培养基成分的破坏。同时，发酵罐利用率也有所降低。分批灭菌所涉及的计算，主要是灭菌时间及热量计算。灭菌主要是在保温过程中实现，在升温段后期，也有一定的灭菌作用。a．灭菌时间计算分批灭菌的时间应参考理论时间作适当延长或缩短。如仅考虑保温时段的灭菌作用，理论灭菌时间NsNokln1=t5-6k是为灭菌常数，s-1灭菌常数k:取决于灭菌温度和灭菌对象，通常以耐热芽孢杆菌为灭菌对象，则为灭菌温度的单一函数，其计算如式(5—5)。例5-1发酵罐内装培养基40m3，121℃分批灭菌。每毫升培养基中含耐热的芽孢为107个，求理论灭菌时间?解：No=40×106×107=4×1014个Ns=0.001个lgk=-（14845/T）+36.127=－（14845/（273+121））+36.127=－1.55k=0.0281s－1τ=24min从该例题可以看出一般采用的灭菌条件121℃、30min是有其理论依据，并被实践所证实了的分批灭菌条件。但例5—1没有考虑升温阶段对灭菌的贡献，实际上保温开始时培养基中活微生物数不是No而是Np，epmNoNpkt=5-8τp为升温阶段时间，可从100℃开始算起，可从经验值或通过热量恒算取得该数值。Km为这一温度段内的灭菌常数之平均值。例5-2根据例5—1中的条件，并且已知升温阶段培养基温度从100℃升到121℃需要20min，考虑这一阶段的灭菌作用，求保温时间?解：Tl=273+100=373K;T2=273+121=384K采用图解积分法可得：分别代入公式5－9、5－8、5－6可得:km＝0.0061s－1Np＝2.65×1011个保温时间τ=1182.1s＝19.7min从例2可以看出，考虑升温段的灭菌作用后，保温时间比不考虑的减少了18％。因此，发酵罐体积越大，其分批灭菌的升温时间长，就更应考虑升温段的灭菌作用，其保温时间应更短。从图5—5可看出，发酵罐体积越大，培养基在高温下持续时间也越长，遭受破坏也越严重。这正是大体积培养基灭菌常选用连续灭菌的原因。b.分批灭菌的热量计算分批灭菌的热量计算主要包括三个方面：1)升温阶段的热量计算2)保温阶段的热量计算3)降温阶段的热量计算①、升温阶段A、采用蒸汽通入夹套或蛇管方式加热B、直接蒸汽加热升温阶段的灭菌度：附：升温阶段灭菌度的简易算法：②、保温阶段在此阶段，蒸汽仍不断通人发酵罐，而由发酵罐的若干排气排出。此时蒸汽消耗量可用下式估算。vPFst19.1=5-12F：蒸汽排出口的总面积，m2；P：罐内蒸汽的绝对压力，atm；V：蒸汽的比体积，m3／kg因排气口由阀门来控制，而阀门开启时的通道面积难以估计。公式5-12中较难确定的是排气口面积F。一般以经验来估计保温时的蒸汽耗量，例如，可估计为直接加热时的30％～50％。这样，一个10m3罐(内装7t培养基)升温时大约耗用蒸汽1.6t，则保温时估计蒸汽耗量为0.5—0.8t，共约需蒸汽2.1～2.4t。空罐灭菌时消耗的蒸汽体积可估计为罐体积的4—6倍。③、降温阶段在发酵罐体积越来越大的今天，分批灭菌的对培养基成分破坏大、升降温时间长这一缺点就更为突出。而以“高温、快速”为特征的连续灭菌能够很好的避免了这一缺点。连续灭菌：就是将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。三、培养基的连续灭菌连续灭菌的设备流程图如图5—6：图5－6培养基连续灭菌设备流程连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到灭菌温度(130—140℃)，短时间保温(5—8min)后，被快速冷却，再进入早已灭菌完毕的发酵罐。连续灭菌注意事项：发酵罐应预先前先进行空罐灭菌。加热器、维持罐及冷却器也应先行灭菌。培养基的不同成分(耐热与不耐热、糖与氮源)可在不同温度下分开灭菌，以减少培养基受热破坏的程度。连续灭菌的优点：对培养基破坏小、可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量平稳。连续灭菌的缺点：对加热蒸汽的压力要求较高，一般不小于0.45MPa。需要附加设备，设备投资大培养基灭菌具体采用那一种灭菌方式，应视培养基的成分、体积，结合当地蒸汽、发酵罐、场地等情况，分析两种灭菌法的优缺点而确定。一旦确定采用连续灭菌，也要考虑到万一蒸汽压力不够时和灭菌不透时改用分批灭菌的设备余量。连续灭菌的操作单元：配料、预热、加热、保温、降温。(1)、配料配料罐用于培养基的配制。然后将培养基用泵打入预热桶中。(2)、预热预热桶的作用：定容、预热。预热的目的：使培养基在后续的加热过程中能快速地升温到指定的灭菌温度，同时可避免太多的冷凝水带人培养基，还可减少震动和噪声。一般可将培养基预热到70～90℃。(3)、加热预热好的培养基由连消泵打入加热器。加热器也称连消塔，使培养基与蒸汽混合并迅速达到灭菌温度。加热采用的蒸汽压力一般为0.45～0.8MPa，加热器有塔式加热器和喷射式加热器两种见图5—7。加热的目的：使培养基在较短的时间(20—30s)里快速升温。图5－7；连续灭菌的加热设备设培养基流量为G，m3／s；进入加热器的温度为tp。；灭菌温度为t；由热量平衡得加热蒸汽用量为ρ：为培养基的密度，kg／m3；C：培养基的比热容，J／kg；CW：水的比热容，J／kg入：加热蒸汽的热焓，J／kg。a．塔式加热器塔式加热器由一根多孔蒸汽管和一根套管组成。多孔管孔径5～8mm，小孔总截面积应等于或小于管截面积。小孔以管壁成45o夹角开设，上稀下密，以使蒸汽能均匀地从小孔喷出。培养基由下端进入，在内外管环隙内流动，流速0.1m／s左右。与蒸汽激烈混合而加热。塔的有效高度为2～3m，料液在加热塔里停留20～30s。塔式加热器的导入管和外套管的管径、塔高和导入管壁上的小孔数目可按下列公式计算：ws.svd7850＝内wt＝H）（孔内＝ddn2adD.svG27850外内++=w5-175-155-165-18d内：蒸汽导人管内径，m；S：加热蒸汽用量，kg／s；υ：加热蒸汽的比体积，m3／kg；ωs：加热蒸汽在导管内的流速，常取20~25m／s；D内：加热塔内径，m；G：培养基体积流量，m3／s；ω：培养基在环隙中的流速，m／s；H：加热塔高度，m；d孔：小管内径，m。τ：物料在加热塔内的停留时间，s；n：导人管上小孔数，个；d：小孔总截面积和导人管截面积之比值一般取0.8－1.0；式中：b．喷射式加热器国内大多