第二章 基因工程及其在食品工业中的应用-1-考研

第二章基因工程及其在食品工业中的应用基因工程概述基因工程工具酶基因工程载体目的基因的制备基因的克隆与检测外源基因的表达基因工程在食品工业中的应用基因是什么？1.基因（gene）具有遗传效应的DNA分子片段，是遗传物质最小功能单位。2.基因组（geneome）一个生物体的全部基因序列。DNA双螺旋结构碱基互补配对，氢键扭曲盘绕DNA超螺旋结构3',5‘-磷酸二酯键含氮碱基+磷酸根+脱氧核糖聚合A(腺嘌呤)G(鸟嘌呤)C(胞嘧啶)T(胸腺嘧啶)核苷酸脱氧核糖核酸（一级结构）（二级结构）（三级结构）（基本单位）什么是DNA？腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）A=TG=CA+G=C+T嘌呤数=嘧啶数嘌呤和嘧啶之间通过氢键相连碱基互补配对原则磷酸二酯键扭曲DNA（脱氧核糖核酸）是一种分子，可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作。基本单位：核苷酸脱氧核糖磷酸根4种含氮碱基分子结构一级结构：二级结构：三级结构：核苷酸序列（核苷酸组成的单链）双螺旋结构超螺旋结构四级结构、拓扑结构配对原则：碱基互补配对A=T，C=G，A+G=C+TDNA的复制意义：将遗传信息从亲代传给子代，从而保持了遗传信息的连续性方式：半保留复制——DNA在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用生成两个新的DNA分子。子代DNA分子其中的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种方式称半保留复制。解旋旧链新链碱基互补配对半保留复制的意义：使亲代DNA所含的信息以极高的准确度传递给子代DNA分子基因的表达——转录、翻译在细胞核（拟核）内，以DNA的一条链为模板，合成信使RNA（mRNA）mRNA核糖体tRNA转录翻译在细胞质中，以mRNA为模板，合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质中心法则4碱基：A、G、C、U（尿嘧啶）U取代T密码子密码子密码子甲硫氨酸天冬门氨酸异亮氨酸mRNA反密码子决定氨基酸解读密码子引入氨基酸tRNA转录和翻译的意义：表达遗传信息，使生物表现出各种性状基因表达的条件1.启动子与RNA聚合酶结合并启动转录的DNA序列。决定DNA活动的开关。共有序列TTGACTATAAT转录酶催化mRNA合成2.SD序列在翻译过程中，mRNA中结合原核生物核糖体的序列，是起始密码子AUG上游3~10bp处由3~9个碱基组成的一段富含嘌呤的序列。该序列与核糖体16SrRNA的3‘端互补配对,促使核糖体结合到mRNA上,有利于翻译的起始。真核生物缺乏此序列3.起始密码子mRNA上编码第一个氨基酸的密码子。大多数生物的起始密码子是AUG（甲硫氨酸），某些微生物的起始密码子是GUG（缬氨酸）4.终止子给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列5.表达产物的后加工在真核细胞中，有时会将无活性的前体蛋白质进修修饰，使之具有活性基因结构基因表达的调控原核生物——操纵子转录的功能单位。很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括调节基因、启动基因、操纵基因和结构基因的整个DNA序列。控制阻遏物的形成抑制操纵基因不受外界影响编码蛋白质•乳糖操纵子ZYA阻遏蛋白抑制启动子和RNA聚合酶的结合抑制转录off×异构乳糖进行转录on构象改变弱启动子负调控细菌优先利用葡萄糖有葡萄糖，没有乳糖抑制启动子和RNA聚合酶的结合抑制转录off阻遏蛋白有葡萄糖，有乳糖异构乳糖进行转录on弱启动子乳糖被利用少阻遏蛋白无有葡萄糖，有乳糖异构乳糖进行转录on大量表达阻遏蛋白激活无葡萄糖，无乳糖cAMP-CAP蛋白激活阻遏蛋白××无法表达真核生物基因调控表达调控环节更多，受多个调控序列共同作用真核基因的转录与染色质的结构变化相关转录、翻译后的加工处理系统真核生物转录水平的调控顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，本身不编码蛋白质。包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件。反式作用因子：能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。原核基因真核基因场所细胞质，转录与翻译偶联，连续进行转录（细胞核）翻译（细胞质）分开进行顺反子多顺反子（一条mRNA编码多个肽链，共用启动子与终止子）单顺反子（一条mRNA编码一个肽链）调控程序操纵子多种调控序列协同作用（顺式作用元件、反式作用因子）调控手段负调控为主正调控为主加工过程无内含子，无需转录后的加工处理转录后对初级产物进行修剪和修饰，剪去内含子，连接外显子其它一种RNA聚合酶参与，无需转录因子3种RNA聚合酶参与，需转录因子原核基因与真核基因调控的对比（结构基因）•基因工程——在分子水平上对基因进行操作的技术体系，将某一种生物细胞的基因提取出来或人工合成的基因，在体外进行酶切或连接到另一种生物的DNA分子中，由此获得的DNA成为重组DNA，将重组DNA导入到自身细胞或其他生物细胞中进行复制和表达等实验手段，使之符合人类需要的遗传新特征，或创作出新的生物类型。•基因——存在于染色体上具有遗传效应的DNA分子片段，是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本单位。意义：1.把遗传信息传给下一代2.表达遗传信息意义：1.定向改造某些性状2.克服远缘杂交§1.基因工程概述•基因工程的三大理论基础（1）1944年Avery通过肺炎双球菌体外转化实验，证明了生物遗传物质的化学本质是DNA；（2）1953年Wastson和Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和传递问题（3）1961年Crick提出蛋白质合成的“中心法则”；1964年Nirenbery和Khorana等破译了64个遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题重组DNA载体限制性内切酶连接酶基因工程的流程+限制性内切酶§2.基因工程工具酶——对基因进行剪切、拼接和组合限制性（核酸）内切酶（基因的剪刀）——一类能识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切酶。已分离出175种，80种用于切割DNA双链。EcoRI细菌属的第一个字母细菌种名的前两个字母菌株的第一个字母该菌株中分离出的第一种内切酶三字母符号斜体EscherichiacoliRY13命名一一对应特定切点磷酸二酯键限制性内切酶种类根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeⅡ）及第三型（TypeⅢ）1.I类限制性内切酶结构：由三种不同的亚基组成，辅助因子为ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸特点：识别和结合特定的DNA序列位点，随机切断识别位点以外的DNA序列，通常在识别位点1000bp范围。切割序列无专一性。举例：EcoK、KcoB2.Ⅲ类限制性内切酶结构：由两个不同的亚基组成，辅助因子为ATP、Mg2+特点：切割位点在识别序列周围24~26bp，对DNA链的识别序列是非对称的，不能产生特异性的DNA片段。举例：EcoPI、HinFⅢ基因工程中基本不使用I和Ⅲ型限制酶Ⅱ类限制性内切酶结构：由两个亚基构成，辅助因子为Mg2+特点：能够识别专一的核苷酸序列，并在该序列内固定位置上或其附近特异切割，从而得到同样末端核苷酸顺序的DNA片段，而且还能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子。举例：EcoPI、HinFⅢ基本特征：（1）识别特定序列严格识别识别序列碱基数一般为4~8bp识别序列富含GC常具有180°旋转对称性的大多数识别更长序列能识别多种核苷酸(HinDⅡ识别-GTPyPuAC-)另外C/TA/G回文结构DNA的两条链呈反向重复状态解链回文序列发夹结构意义：1.限制性内切酶的识别位点2.调节基因的表达3.稳定RNA的结构和行使功能切割过程同时切割同时切割（2）切割方式黏性末端5‘突出的黏性末端3‘突出的黏性末端EcoRIPstI平末端HaeⅢ限制酶交错切割DNA双链而形成的彼此互补的单链末端，可形成氢键在识别处对称轴平齐切割DNA两条链而形成的平头双链末端5'-GAATTC-3'3'-CTTAAG-5'5'-G3'-CTTAAAATTC-3'G-5'5'-CTGCAG-3'3'-GACGTC-5'5'-CTGCA3'-GG-3'ACGTC-5'5'-GGCC-3'3'-CCGG-5'5'-GG3'-CCCC-3'GG-5'5'突出的黏性末端5'突出的黏性末端3'突出的黏性末端平末端连接酶（基因的针线）——能将两段DNA拼接起来的酶类，这类酶能够催化双链DNA分子中相邻3'-羟基末端与5'-磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。即将限制性内切酶“剪”出的末端重新组合。作用：粘性末端DNA片段的连接平末端DNA片段的连接催化外源DNA和载体分子连接把梯子两边的扶手连起来大肠杆菌DNA连接酶：连接黏性末端T4噬菌体连接酶：连接黏性末端和平末端，效率低只能连接DNA双链！（DNA）甲基化酶——能够识别DNA特定序列，并在其特定位置上引入甲基进行修饰的一类酶。用途：与限制性内切酶具有相同的识别序列，甲基化酶使序列中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。DNA聚合酶作用：参与DNA复制，以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'①5'3'的聚合作用，可修补DNA或切除RNA引物后留下的空隙②3'5'外切酶活性，消除在聚合作用中参入的错误核苷酸③5'3'的外切酶活性，切除受损伤的DNA（切除修复）例子：大肠杆菌DNA聚合酶I——具有①②③大肠杆菌Klenow片段——具有①②，无③，可用于填补DAN单链末端成为双链碱性磷酸酯酶——来自大肠杆菌和牛小肠，能催化DNA、RNA、NTP和dNTP分子中除去5'-磷酸基团作用：①去除DNA两端5'-磷酸基，防止DNA自我环化②同位素32P标记5'-OH末端制备DNA或RNA探针时，先用该酶去除5'-磷酸基，产生5'-OH末端，再进行标记（校对）T4多聚核苷酸激酶作用：①为DNA的5'末端进行标记②对准备连接但缺乏5'-磷酸基的DNA或化学合成片段的5'-OH加上磷酸基团S1核酸酶——特异降解单链DNA或RNA，产生带5'-磷酸基的单核苷酸或寡核苷酸逆转录酶——以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）。可用该酶获得目的基因，也可用来标记cDNA作为放射性分子探针谢谢！