黄酮类化合物的检识与结构鉴定

第四节黄酮类化合物的检识与结构鉴定目前主要采用的方法有：①与标准品或与文献对照PPC或TLC得到的Rf或hRf值（Rf100）②分析对比样品在甲醇溶液中及加入诊断试剂后得到的UV光谱③1H-NMR④13C-NMR⑤MS一、色谱在黄酮类鉴定中的应用1.纸层析(PPC)苷类成分可采用双向展开，第一相展开采用醇性溶剂，如BAW系统（正丁醇：醋酸：水4：1：5上层）；第二相展开用水性溶剂，如氯仿：醋酸：水（3：6：1）苷元则多采用醇性溶剂。花色苷及其苷元，可用含盐酸或醋酸的溶剂。显色剂：2%三氯化铝甲醇液（紫外光下检测）；1%FeCl3/1%K3Fe(CN)6(1:1)混合液。2.薄层层析(TLC)１）硅胶薄层用于弱极性黄酮较好。常用甲苯：甲酸甲酯：甲酸（5：4：1）；苯：甲醇（95：5）或苯：甲醇：冰醋酸（35：5：5）等。２）聚酰胺层析适用范围广，可分离含游离酚羟基或其苷类。常用展开系统：乙醇：水（3：2）；丙酮：水（1：1）等。二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用可用于确定黄酮母核类型及确定某些位置是否含有羟基。一般程序：①测定样品在甲醇中的UV谱以了解母核类型；②在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后测UV谱和可见光谱以了解3,5,7,3’,4’有无羟基及邻二酚羟基；③苷类可水解后（或先甲基化再水解），再用上法测苷元的UV谱以了解糖的连接位置。（一）黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外光谱多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成：带I在300-400nm区间，由B环桂皮酰系统的电子跃迁所引起。OOOOBB带II在240-285nm区间，由A环苯甲酰系统的电子跃迁所引起。OOOOAA带II(240-285nm)（苯甲酰系统）带I(300-400nm)桂皮酰系统类型说明250-285304-350黄酮类-OH越多，带I带II越红移B环3’,4’有-OH基，带II为双峰（主峰伴肩峰）328-357黄酮醇类(3-OR)352-385黄酮醇类(3-OH)245-270270-295300-400异黄酮类二氢黄酮（醇）B环上有-OH,OCH3对带I影响不大220-270340-390或340-390(Ia)300-320(Ib)查耳酮类查耳酮2’-OH使带I红移的影响最大370-430(3-4个小峰)橙酮类不同类型黄酮类化合物的紫外光谱2．加入诊断试剂后引起的位移及结构测定加入试剂带II带I说明样品+MeOH（黄酮类及黄酮醇类）250-285304-385两峰强度基本相同，具体位置与母核上电负性取代基(-OH,-OCH3)有关，-OH,-OCH3越多，越长移+NaOMeA环有-OH，红移小，无意义40-60nm（不变或增强）50-60nm（下降）有4’-OH，无3-OH有3-OH，无4’-OH有3,4’-OH或3,3’,4’-OH（衰减更快）7-OH带I，II随加NaOMe时间延长，逐渐衰减320-330nm有吸收，成苷后消失+NaOAc(未熔融)5-20在长波一侧有明显的肩峰7-OH+NaOAc(熔融)40~65有4’-OH+NaOAc/H3BO35-1012-30有6,7-OH或7,8-OH(5,6-OH无)B环有邻二酚羟基AlCl3/HCl6050-6035-5517-200有3-OH有3,5-二OH有5-OH，无3-OH有6-OR无3-OH,5-OHAlCl3光谱-AlCl3/HCl光谱30-4050-650B环有邻二酚羟基A,B环皆有邻二酚羟基A,B环皆无邻二酚羟基说明：（1）+NaOMe或NaOAc,OHONa，变为离子化合物，共轭系统中的电子云密度增加，红移另有3,4’-OH或3,3’,4’-OH时，在NaOMe作用下易氧化破坏，故峰有衰减。（2）NaOAc为弱碱，仅使酸性较强者，如7,4’-OH解离。（3）HCl/H2OAlCl3Al3+OOOHOHOHOAl3+Al3+OOOOOHOOOOHOHHOOH形成络合物的能力：黄酮醇3-OH黄酮5-OH（二氢黄酮5-OH）邻二酚羟基二氢黄酮醇5-OH邻二酚羟基和二氢黄酮醇5-OH在酸性条件下不与AlCl3络合；但不在酸性条件下，五者皆与Al3+络合；形成络合物越稳定，红移越多。（4）根据只加AlCl3和加入AlCl3及盐酸的紫外光谱吸收峰位相减的结果，可以判断邻二酚羟基的取代情况。山柰苷山柰酚UVλmax(nm)带II带I带II带IMeOH265345267367NaOMe265388278416（分解）AlCl3275399268424AlCl3/HCl275399269424NaOAc265399276387NaOAc/H3BO3265345267367从中药柴胡中分离得到山柰苷，经酸水解后，用PC检出有鼠李糖，山柰苷及山柰酚的紫外光谱数据如下：OOHOOHrhaOOrha山柰酚3，7-二鼠李糖苷三、1H-NMR常用溶剂：氘代氯仿（CDDl3），氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），氘代吡啶（C5D5N）。也可将黄酮类化合物制成三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中进行测定。黄酮类化合物1H-NMR谱(DMSO-d6)羟基的特征OOHOOHHOOHOH357δ5－OH：≈12ppmδ7－OH：≈11ppmδ3－OH：≈10ppm氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）对鉴别黄酮母核上的酚羟基，是十分理想的溶剂，在试样中加入重水（D2O）羟基质子信号消失。（一）A环质子1．5,7-二-OH黄酮H-6,H-8,5.7-6.9,J=2.5HzH-6较H-8高场86OOHOOH黄酮类1H-NMR（三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中测定）当7-OH成苷时，则H-6及H-8信号均向低场方向位移。2．7-OH黄酮H-57.7-8.2(d,J=9Hz)H-66.4-7.1(dd,J=9,2.5Hz)H-86.8-7.0(d,J=2.5Hz)5OOHO68H-5较H-6、H-8低场，是由于羰基的负屏蔽效应的影响。H-6、H-8较5,7-二OH黄酮在较低场，且相互位置可能颠倒。（二）B环质子δ6.5-81．4’-氧取代黄酮类化合物5'6'3'2'ORH-3’,5’6.5-7.1,d,J=8.5HzH-2’,6’7.1-8.1,d,J=8.5Hz由于C环对H-2’,6’的负屏蔽作用大于对H-3’,5’，且H-3’,5’受4’-OR的屏蔽作用，故前者较低场；C环氧化程度越高，H-2’,6’处于越低场的位置。2．3’,4’-二氧取代黄酮类化合物5'6'2'ORORH-2’受C环负屏蔽和3’-OR屏蔽作用，H-6’也受C环负屏蔽作用，而H-5’则仅4’-OR屏蔽作用。故由低场到高场的顺序为：H-6’H-2’H-5’。但有时也会发生H-2’和H-6’重叠的现象。（1）3’,4’-二氧取代黄酮及黄酮醇H-5’6.7-7.1d,J=8.5HzH-2’7.2d,J=2.5HzH-6’7.9dd,J=2.5,8.5Hz（2）3’,4’-二氧取代异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇H-2’,5’,6’常作为一个复杂多重峰（通常为两组峰）6.7-7.15'6'2'OROR3．3’,4’,5’-三氧取代黄酮类化合物6'2'OR2OR1OR3若R1=R2=R3=H，则H-2’,6’为单峰，6.7-7.5若上述条件不成立（如3’或5’甲基化或苷化时），则H-2’,6’分别为二重峰（J=2Hz）（三）C环质子1.黄酮类H-3,6.33OHO2.异黄酮类32OOHH-2位于羰基位，同时受羰基和苯环的负屏蔽作用，且通过碳与氧相连，故较一般芳香质子低场，δ7.6-7.8。若用DMSO-d6作溶剂，则δ8.5-8.7。3.二氢黄酮和二氢黄酮醇1)二氢黄酮23OHOH两个H-3,分别为dd峰，中心位于δ2.8，J=17Hz（偕偶），5Hz（顺偶）及J=17Hz（偕偶），11Hz（反偶）H-2,dd,δ5.2,Jtrans=11Hz（反偶）,Jcis=5Hz（顺偶）（2）二氢黄酮醇32(2S,3S)二氢黄酮OOHOHH3-OH苷化，供电子能力下降，两个氢的δ值升高（向低场位移），可用于判断二氢黄酮醇苷中糖的位置。H-2与H-3为反式双直立键，J=11HzH-2δ4.9H-3δ4.3H-α：δ6.50-6.70(1H,d,J=Ca.17.0)H-β：δ7.30-7.70(1H,d,J=Ca.17.0)OHHαβ?查耳酮：苄氢:δ6.50-6.70(1H,s)δ6.37-6.94(1H,s,DMSO-d6)CHOO橙酮：（四）糖上的质子1.单糖苷类糖与苷元相连时，糖上1˝-H与其它H比较，一般位于较低磁场区。因-OR(R=苷元)不表现供电子，仅表现吸电子的诱导作用，端基H受两个O的诱导，处于低场（4.0-6.0）1）葡萄糖位于不同位置时端基H化学位移的区别：C3-OR1˝-H的值约为5.8C-5,C-6,C-7,C-4’-OR1˝-H的值约为4.8-5.22)葡萄糖苷与鼠李糖苷的区别黄酮醇3-O-葡萄糖苷5.8,d,J=7Hz（二直立键偶合系统）黄酮醇3-O-鼠李糖苷5.0-5.1,d,J=2Hz（二平伏键偶合系统）另外鼠李糖上的C-CH30.8-1.2,d,J=6.5Hz-L-rha-D-glc2''2''1''1''OORH(e)H(e)OHHH3CHOHHOHOORH(a)H(a)OHHOHHHOOH化合物糖上的H-1’’黄酮醇3-O-葡萄糖苷5.70-6.00黄酮醇7-O-葡萄糖苷4.80-5.20黄酮醇4'-O-葡萄糖苷黄酮醇5-O-葡萄糖苷黄酮醇6及8-C-糖苷黄酮醇3-O-鼠李糖苷5.00-5.10二氢黄酮醇3-O-葡萄糖苷4.10-4.30二氢黄酮醇3-O-鼠李糖苷4.00-4.20糖上的氢2.双糖苷类末端糖上的H-1’’’因离黄酮母核较远，受到的负屏蔽作用较小，因而较H-1’’处于较高场的位置。取代基δ甲基2.04-2.45(3H,s)乙酰氧基2.30-2.45(3H,s)甲氧基3.45-4.10(3H,s)苯环上其他取代基的氢：四、13C-NMR方法：（1）对比法：与简单的模型化合物如苯乙酮、桂皮酸及它们的衍生物光谱的比较；（2）计算法：用经验的简单芳香化合物的取代位移加和规律进行计算；（3）选用各种一维和二维NMR技术。（一）骨架类型的判断根据中央三碳链的碳信号，即先根据羰基碳的δ值，再结合C2、C3在偏共振去偶谱中的裂分和δ值判断。C=OC-2（或C-β）C-3（或C-α）归属174.5~184.0(s)160.5~163.2(s)104.7~111.8(d)黄酮类149.8~155.4(d)122.3~125.9(s)异黄酮类147.9(s)136.0(d)黄酮醇类182.5~182.7(s)146.1~147.7(s)111.6~111.9(d)(=CH-)橙酮类188.0~197.0(s)136.9~145.4(d)116.6~128.1(d)查耳酮类75.0~80.3(d)42.8~44.6(t)二氢黄酮类82.7(d)71.2(d)二氢黄酮醇类（二）黄酮类化合物取代图式的确定方法黄酮类化合物中芳香碳原子的信号特征可以用来确定取代基的取代图式。以黄酮为例，其13C-NMR信号如下所示：flavone118.3156.3163.2131.8126.3131.6129.0OO129.0126.3178.4107.6133.7125.2125.71．取代基位移的影响XZiZoZmZpOH26.6-12.81.6-7.1OCH331.4-14.41.0-7.8-OH及-OCH3的引人将使直接相连碳原子(α-碳)信号大幅度地向低场位移，邻位碳原子(β-碳)及对位碳则向高场位移。间位碳虽也向低场位移，但幅度很小。A-环上引入取代基时，位移效应只影响到A环，而B-环上引入取代基时，位移效应只影响到B环。若是一个环上同时引入几个取代基时，其位移效应将具有某种程度的加和性。黄酮母核上引入5-OH时，不仅影响A环碳原子的化学位移，还因C5