抗真菌药物敏感性测试在真菌感染防治中的作用

抗真菌药物敏感性测试在真菌感染防治中的作用随着高效广谱抗生素的广泛应用，抗肿瘤治疗的深入开展，器官移植和外科其他介入性治疗的不断应用，皮质类固醇激素的广泛应用，以及获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者的不断增多，侵袭性真菌感染的发生呈现上升趋势，真菌感染的病情亦十分严重，念珠菌已经成为引起血生感染的第4位的病原菌，侵袭性曲霉病已经成为白血病和骨髓移植受者重症免疫受损（immunocompromised）机体发生死亡的主要原因[1、2]。除了常见病原真菌感染的数量不断增多外，一些少见或罕见真菌引起的感染也时有报告，因此，越来越我的临床和科研工作都在关注着真菌感染的防治。面对病原真菌的种类和真菌感染类型的不断增多，以及新型抗相真菌感染患者的生命，具有特别重要的意义。抗真菌药物敏感性试验（药敏试验）是测定病原真菌对抗真菌药物的敏感性或者说是测定抗真菌药物对病原真菌的抑制活性的体外试验方法，其应用经历了不同的发展过程。在唑类药物问世之前，由于两性霉素B是惟一可用于治疗系统性真菌感染的药物，且未广泛用于临床抗真菌药物的筛选。三唑类药物在临床上的应用，为真菌感染的有效治疗提供了更多选择，但临床上也出现了一些耐药菌株，抗真菌药敏试验也由此逐渐发展完善，以满足合理选择药物、筛选取耐楷株的临床需要。抗真菌药敏试验方法包括琼脂稀释法、纸片扩散法、浓度梯度法和液体培养基稀释法等。以往、由于不同实验室所用的试验方法不同，甚至同一方法操作者不同，以致抗真菌药敏试验结果的可重复性和一致性均较差，不利于临床合理选择抗真菌药物。1997年，美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）分布了致病性酵母菌抗真菌药敏试验方案M27-A，对于培养基的成分和pH值、接种浓度、孵育温度，孵育时间、终点判读标准，以及最低抑菌深度（MIC）折点的意义等做了明确的规定，经过数年的临床实践，证明该方案重复性好，客观性强，值得推广；在此基础了，NCCLS于2002年又发表了产孢丝状真菌防治及检验工作的同道进行示范，起了积极的推广作用。普及推广应用这些标准的试验方案，具有十分重要的意义，但是，如何更加规范操作程序、准确判读并分析试验结果，了解其与临床疗效之间的关系，切实发挥抗真菌药敏试验在真菌防治中的作用是一项更为重要的任务。一、NCCLS体外抗真菌药敏试验及其规范化1．规范质量控制：为保证试验程序、试验条件以及操作者判读结果的精确性，每次试验必须按照NCCLS的规定，做好质控。这一点是十分重要的。例如M38-A规定，按照该方案的程序操作，48h后伊曲康唑对于质控菌株近平滑念珠菌ATCC22019的MIC范围应为0.2~0.5ug/ml；如果MIC值低于0.12ug/ml，很可能配制的伊曲康唑的浓度偏高，导致MIC结果偏低，这样就会掩盖一些耐药菌株；相反，如果MIC值高于0.5ug/ml，同样可导致结果偏高，所报告的耐药菌株数量全增多，实际上这些都是假象，但可能会对临床产生很在的影响。因此，实际工作当某个联合某个地区或者某个实验室测得的耐药菌株数量不明原因增多时，操作者应该重新认真进行质控检测，以排除假象的干扰。2．规范操作程序：NCCLS方案规定，药敏试验所涉及的各种条件都有应当统一，例如培养基为液体RPMI-1640（pH7.0）孵育温度为35℃、接种量为（0.5~5）×104/ml（丝状菌）、脂溶性药物溶媒的浓度小于1%等，在实际工作中，操作者应该严格执行；尤其在接种菌定量方面，虽然NCCLS方案建议选用比浊仪，以麦氏读数为0.5时的细胞数定为1~5×106CFU/ml，但实际上由于这一范围相差5倍左右，仍然有失精确，所以我们建议必要时使用血细胞计数板进行计数。规范结果判读：药物的抗真菌活性或者真菌原对药物的敏感性，是通过抗真菌药和的MIC反映出来，所以药敏试验结果的判读非常重要，以M27-A2为例，氟康唑对于念珠菌属的MIC定义为，孵育48h后，与生长对照相比较50%生长受抑时的MIC；其判读折点的意义在于，如果MIC≤8ug/ml则提示受试菌对氟康唑敏感，≥64ug/ml则耐药，如果为16~32ug/ml则是剂量依赖。可是在实际工作中，如果进一步影响MIC的判读；因此，M27-A2方案建议，如果孵育24h后生长对照的生长情况理想的话，可以在这时读取MIC，该方案也提供了孵育24h时质量控制的标准，这或许更加便于指导临床及时用药。NCCLS对伊曲康唑抑制念珠菌属的MIC判读标准也做了规定，如果MIC≤0.125ug/ml则提示受试菌对伊曲康唑敏感≥1ug/ml则耐药，如果为0.25~0.5ug/ml则是剂量依赖，我们的体会是，结果判读标准的选择要考虑到药物本身的特性，尤其在比较不同来源的抗真菌药敏试验结果时，更需要注意比较终点判读的标准是否相同，是50%或者80%还是100%生长受抑。二、其他抗真菌药敏试验方法1．浓度梯度法：这是依据抗真菌药物在琼脂内扩散以梯度递减抑制微生物生长的原理设计的一种商品化的抗真菌药敏试验方法；操作简单、直观，受试药物包括氟康唑、伊曲康唑、卡泊芬净和两性霉素B等，用于质量控制的受试菌包括念株菌、隐球菌、曲霉菌和镰刀菌等，其结果与NCCLS方案有较好的一致性；但是，该方法价格昂贵，而且结果的判断要求丰富的经验，因此应当注意总结临床应用的经验。2．纸片扩散法：除了液体培养基稀释法以外，NCCLS于2004年还发表了酵母菌纸片扩散法抗真菌药敏试验方案M44-A；该方案所用的培养基为美蓝M-H琼脂，受试药物为氟康唑（25ug）和伏力康唑（1ug），以近滑念珠菌ATCC22019作质量控制时，其抑菌环直径范围分别为22~23mm和28~37mm受试菌只有念珠菌；对于氟康唑的折点及其与M27-A2之间的一致性也须知了规定，即M44-A测定的抑菌环直径大于19mm时，相当于M27-A2测得的MIC≤8ug/ml，受试菌对氟康唑敏感；抑菌环直径小于14mm时，相当于MIC≥64ug/ml，则耐药；而如果为15~18mm时，相当于MIC为16~32ug/ml，则剂量依赖。这个方案仍然有直观、简便等特点，最近也有商品化的产品问世，但是，临床应用中一定要慎重，同样需要进一步总结经验。3．其他：抗真菌药敏试验还包括ATBFUNGUS2、葡萄糖消耗法等，并在研究开发中，有待用于临床监测。三、抗真菌药敏试验与抗真菌治疗疗效的相关性1．抗真菌药敏试验与抗真菌治疗疗效的致性：开展体外药物敏感性试验的目的在于指导临床合理用药，反映抗真菌治疗的疗效，那么，NCCLS体外抗真菌药敏试验能否起到这一作用呢？数年不的实践证明，在氟康唑对念珠菌的体外抑制活性与氟康唑治疗念珠菌病的体内疗效之间，一致性非常好。有研究显示，服用单剂量氟康唑100mg/d时，血清浓度为6ug/ml；服用400mg/d时，血清浓度为20~30ug/ml；而服用800mg/d时，血清浓度为40~60ug/ml[7]。Ghannoum等[8]总结了发生于AIDS的经氟康唑治疗的食管念珠菌病的数项研究结果，发现以NCCLS方案测定氟康唑对分离自150余例患者的600余株念株菌的MIC值，患者一般均能获得良好的疗效，此时血液药物浓度约为20~60ug/ml[7]；而所有氟康唑MIC＞64ug/ml者，均表现出治疗失败。因此，有学者[9]认为，可以用体外药敏试验结果来指导氟康唑临床用药：即当MIC＜4ug/ml时，氟康唑剂量为100mg/d；当MIC为4~8ug/ml时，剂量为200mg/d；当MIC为8~16ug/ml时，剂量为400mg/d；而当MIC为16~32ug/ml时，剂量为800mg/d。但是，并非所有的体外药敏试验都与体内抗真菌药物的疗效相一致，因为毕竟机休自身的免疫防御机制在真菌感染的发生过程中起十分重要的作用，有研究表明[10]，对于体外药敏试验结果提示敏感的真菌，有91%（838/923）对治疗反应良好，而体外药敏试验结果提示耐药者，仍然有48%（131/274）对治疗反应良好；那么，究竟该如何把握体外药敏试验结果与临床疗效之间的相关性呢？目前国际上有一个比较公认的原则[9]：氟康唑对念珠菌，可以借鉴细菌药敏试验时的“90~60”的原则，即体外药敏试验结果敏感者约有90%临床疗效较好，而体外药敏试验结果耐药者约有60%仍然将对治疗有效[10]。这一提议，为解释体外试验和临床疗效之间的相关性，提供了非常有用的指导，希望对于真菌感染的防治工作有所裨益。2．新型抗真菌药物体外药敏试验的修正：尽管NCCLS方案具有重复性好，一致性强的诸多优点，尤其在测定氟康唑对念珠菌的MIC时，还可以取得与临床疗效一致性很好的结果，但是并非所有受试药物和病原真菌都是如此。例如卡泊芬净（caspofungin），这是一种通过抑制真菌细胞壁β-1，3葡聚糖的合成不发挥作用的新型抗真菌药物[11]；用NCCLS的M38-A方案测定烟曲霉菌对卡泊芬净敏感性，不同的报告相差悬殊；例如Odds等[11]；报告卡泊芬净对12株烟曲霉菌的MIC为0.06~0.12ug/ml，Arikan等报告卡泊芬净对26株烟曲霉菌MIC的几何均数在24h为0V3ug/ml，而72h大于16ug/ml；Espinel—Ingroff[12]报告卡泊芬净对烟曲霉的MIC，72h几何均数为2.15ug/ml而DelPoeta用试管稀释法得到的结果则低于0.09ug/ml；这种情况当然不利于进行安定之间的比较，并指导临床用药。于是，人们引进最低有效浓度（MEC）不描述卡泊芬净对曲霉菌的抑制活性[12]，实际上MEC就是使曲霉菌产生明显异常菌丝时的最低卡泊芬净浓度；全球15个以上的实验室的实践证明，用MEC来描述曲霉菌对卡泊芬净的敏感性，较MIC可以产生非常显著的可重复性。3．测定最小杀菌浓度（MFC）的价值：尽管由于对试验的各种条件都作了统一规定，应用NCCLS方案测定抗真菌药物对病原真菌的抗菌活性。譬如，我们在体外有氟康唑将烟曲霉菌处理后[13]，再用NCCIS方案M38-A测定伊曲康唑对它的MIC时，发现与未处理者并无差异，但是最低杀菌浓度（MFC）却显著升高，这一现象经荧光染料对菌丝染色而得到证实，并且与临床上经氟康唑预防性治疗的白血病和骨髓移植受者中侵袭性曲霉病发生率明显升高的现象相一致。所以，应当重视测定MFC。总之，随着医学真菌学的飞速发展，抗真菌药物敏感性试验不论方法学还是临床应用，都取得了长足进展；我们认为，目前需要进一步普及和推广规范的抗真菌药物敏感性试验法，争取不同地区，不同实验室之间在操作规范、结果准确等方面确实具有可比较性，这样，一方面可以发挥抗真菌药敏试验切实指导临床用药的作用，另一方面，对开展全国范围的抗真菌药物耐药性监测具有十分重要的意义。侵袭性真菌感染的临床研究进展一、流行病学的变迁近20余年来，由于干细胞移植、实体器官移植、肿瘤化疗、大剂量广谱抗菌药物的长期应用，以及糖皮质激素、免疫抑制剂的广泛应用等因素，侵袭性真菌感染的患病率和病死率均呈显著上升趋势。首先是念珠菌感染率显著上升，在20世纪80年代初期，住院患者念珠菌所致败血症的患病率为2%，20世纪80年代后期增至5%，而到了20世纪90年代后已达8%，有1组研究报道在ICU患者真菌败血症患病率竟高达12%。与此同时，非白念珠菌引起的侵袭性感染比例也明显增多，上世纪60～70年代，白念珠菌感染高达85%～90%，然而在1988到1992年间，据一癌症研究中心研究发现，非白念珠菌感染的发生率超过白念珠菌，仅42%侵袭性念珠菌感染是由白念珠菌所致，而其余均为非白念珠菌，包括热带念珠菌(18%)，近平滑念珠菌(17%)，光滑念珠菌(11%)，克柔念珠菌(4%)。在非癌症研究中心也得到相类似的调查结果，有学者推测可能与氟康唑的广泛预防应用有很大关系。迄今为止，念珠菌仍旧是医院感染最常见的致病性真菌，在美国每年100000住院患者中就有6-23例发生侵袭性念珠菌感染，并成为血行感染的最常见病原菌之一，约占8%-10%。其中白念珠菌所占比例明显下降，非白念珠菌中光滑念珠菌、近