全国流感监测技术指南

全国流感监测技术指南为进一步规范我国流感监测工作技术环节，科学指导全国流感监测网络和各级疾病预防控制机构做好流感监测工作，依据《全国流感监测工作方案（2010年版）》,特制定本指南。一、监测目的（一）监测流感活动水平和流行动态；（二）及时发现流感病毒变异；（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。二、流感样病例监测（一）监测病例定义流感样病例：发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。（二）监测时间所有流感样病例监测哨点医院和流感监测网络实验室均全年开展流感样病例监测。每年4月1日所在周至次年4月1日所在周前一周为一个流感监测年度。流感监测周历编排标准参照ISO8601，按照公历的每周一到每周日编排（注释：如1月1日为周一至周四，该周属于新年第一周；如1月1日为周五至周日，该周则属于上一年最后一周；周一为每周第一天）（附件1）。（三）哨点医院监测诊室的设置1．综合医院在内科门诊、内科急诊、发热门诊和（或）儿内科门诊、儿内科急诊开展流感样病例的监测；其中，开展流感样病例监测的内科门诊应包括所有内科诊室和感染性疾病科。2．儿童医院在儿内科门诊、儿内科急诊和（或）发热门诊开展流感样病例的监测；如哨点医院儿内科门诊有细分的科室，则所有儿内科诊室均应开展流感样病例监测。3．所有国家级流感样病例哨点监测医院都应按要求规范设置监测诊室，不能仅将发热门诊设为监测诊室。（四）流感样病例的报告1．报告内容和程序（1）哨点医院监测诊室的医务人员，按照流感样病例的定义，对每天在所有监测诊室就诊的病例进行诊断，每天按科室登记各年龄组的流感样病例数和门急诊病例就诊总数，填写“医院科门（急）诊流感样病例数和门急诊病例就诊总数原始登记表”（附表1），报医院主管科室。原始登记表中“流感样病例数”和“门急诊病例就诊总数”可分科室、诊室，由各科室确定专人每日进行登记。（2）哨点医院主管科室，每周一负责将本院各监测诊室上周的“医院科门（急）诊流感样病例数和门急诊病例就诊总数原始登记表”（附表1），分诊室录入“中国流感监测信息系统”。2．注意事项流感样病例数和门急诊病例就诊总数在每个监测诊室的产生来源必须一致。（五）流感样病例标本的采集和运送上海、江苏、浙江、安徽、福建、江西、湖北、湖南、广东、广西、海南、重庆、四川、贵州、云南等15个南方省份每家哨点医院每周采集5-15份流感样病例标本。北京、天津、河北、山西、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江、山东、河南、西藏、陕西、甘肃、青海、宁夏、新疆等16个北方省份和新疆生产建设兵团每家哨点医院在4月-9月间每月采集5-15份流感样病例标本，10月-次年3月间每周采集10-15份流感样病例标本。标本采集日期应均匀分布，避免集中、突击采样。哨点医院监测诊室的医护人员采集流感样病例标本时，须填写“流感样病例标本原始登记送检表”（附表2），随同标本送至对应的流感监测网络实验室。1．采样对象：发病3天内的流感样病例。2．标本采集种类包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子。标本采集后，放入含采样液3～4mL的采样管中。采集方法详见附件2。3．标本的运输：标本采集后应在4℃条件下，48小时内运送至对应的流感监测网络实验室。如未能48小时内送至实验室，应置-70℃或以下保存，并保证采集的标本一周内送到对应的网络实验室。标本应避免反复冻融。标本运输方法详见附件2。4．全国流感监测网络实验室的工作人员接到标本后，48小时内将“流感样病例标本原始登记送检表”（附表2）录入到中国流感监测信息系统“流感样病例标本登记表（信息系统用）”中（附表3）。（六）流感样病例标本的实验室检测1．实验室条件及生物安全操作要求开展流感样病例病原学监测的实验室必须是生物安全Ⅱ级或以上实验室，具备以下病毒分离鉴定的条件和相关仪器设备。（1）流感病毒分离必须在生物安全Ⅱ级或以上实验室的生物安全柜内操作，并遵守相关的生物安全管理规定。（2）红细胞凝集（HA）和红细胞凝集抑制（HI）试验在生物安全Ⅱ级实验室里操作，并遵守相关的生物安全管理规定。（3）实验室基本条件：具备进行流感病毒分离鉴定所需要的生物安全柜、倒置显微镜、离心机、CO2培养箱、恒温培养箱、液氮罐、普通冰箱、-70℃低温冰箱、PCR仪或Real-timePCR仪、凝胶成像仪等设备。2．病毒分离与鉴定病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。且因“O”相毒株的重现，MDCK细胞对“O”相毒株的敏感性远高于鸡胚，故MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。但考虑目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK细胞分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。若同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下冻存的原始标本用鸡胚进行病毒分离。流感监测网络实验室收到标本后，要求在24小时内进行标本处理和病毒分离。（1）标本的处理：将原始标本分为三份，一份用于MDCK细胞接种，一份鸡胚接种，一份-70℃或以下温度保存待复核。（2）标本的接种、收获和鉴定：要求利用生长状态良好的MDCK细胞和/或鸡胚进行标本分离。标本接种后阴性标本可不再盲传；对于血凝滴度小于1:16的毒株，将病毒培养液进行10-1～10-3稀释后，进行传代。MDCK细胞或鸡胚收获的病毒培养液首先用火鸡、豚鼠或人O型血红细胞进行HA试验，确定病毒滴度。流感病毒“O”相毒株不凝集鸡红细胞，所以不建议使用普通鸡红细胞。HA试验完成后，采用国家流感中心每年分发的各型别/亚型标准参照血清进行HI试验，以确定病毒的型别和亚型。进行HI试验时，需同时采用各型别/亚型的标准抗原作为对照。具体方法参见附件2。不具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到标本后，要在1周内利用核酸检测方法进行流感病毒亚型鉴定。（3）结果录入检测结果在检测完成后48小时内录入到中国流感监测信息系统“流感监测病毒分离、鉴定结果登记表”中（附表4）。3.流感病毒的抗原性分析有条件的网络实验室可对分离的流感病毒，采用同一型别/亚型的标准参照血清（雪貂免疫后抗血清）进行HI试验，通过与阳性对照的HI滴度进行对比，分析流感病毒的抗原性变异情况。4．流感病毒基因特性分析有条件的网络实验室可选取部分毒株进行流感病毒的序列测定和基因特性分析。序列将通过全国流感监测网络基因序列共享数据库（拟于2011年10月前开通）实现辖区内共享，地方各级疾病预防控制中心可利用本辖区的序列信息开展综合分析，提高数据利用能力。5.流感病毒的耐药性监测有条件的网络实验室可进一步通过监测毒株序列中耐药性相关位点的变化或者通过生物学实验，来监测流感病毒的耐药性，为指导抗流感病毒药物的使用提供依据。6．流感毒株的管理和寄送（1）毒株的保存管理包括国家流感中心在内的全国流感监测各网络实验室，要对所有流感毒株进行登记保存，参考使用“流感毒株保存记录表”（附表5），以备复核。毒株鉴定完成后，液体毒株可在-70℃或以下温度条件保存3年，冻干保存的毒株可以4℃及以下温度条件长期保存。各网络实验室对分离出病毒株的原始标本应在-70℃及以下温度条件保存至少6个月。（2）流感毒株/标本的上送各网络实验室对所有血凝滴度≥1:16的流感毒株，同时上送国家流感中心和省级疾病预防控制中心，送检量每份不少于3mL。各网络实验室毒株可由省级网络实验室统一上送，从标本采集到送至国家流感中心的时间间隔不超过1个月。送检的毒株要通过“中国流感监测信息系统”提交送检并打印“流感毒株送检单”（附表6），随同毒株一同寄送。每个开展病毒分离的网络实验室向国家流感中心上送流感毒株数量每年不低于30株，流行季节每月不少于5株。各网络实验室对于HA阳性、但不能区分其型别或亚型的毒株和阳性标本务必在48小时内送至国家流感中心。发现新亚型或疑似新亚型，应当立即上报，同时将相关毒株和阳性标本送国家流感中心复核检测。具体实验操作方法及生物安全操作要求参见附件2。三、流感样病例暴发疫情监测（一）暴发疫情定义1．流感样病例暴发：指同一地区或单位内在较短时间出现异常增多的流感样病例。2．暴发疫情报告标准：（1）1周内，在同一学校、幼儿园或其它集体单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联的死亡病例；（2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内出现流感样病例异常增多。各省（自治区、直辖市）可根据本地疫情特点及防控工作需要，参照上述要求制定更为敏感的暴发疫情报告标准。（二）暴发疫情的发现与报告1．学校、医院等集体单位发现聚集性流感样病例或流感样病例暴发疫情后，应在２小时内以电话或传真等方式向所属地县级疾病预防控制机构（农村学校向当地乡镇卫生院防保组）报告。乡镇卫生院防保组接到报告后，应立即进行疫情核实，并向属地县级疾病预防控制机构报告。获得报告信息的县级疾病预防控制机构，应对信息进行审核，确定真实性，并在2小时内将《突发公共卫生事件信息报告卡》及“流感样病例暴发疫情监测报告表”（附表7）进行网络直报。为确保各级疾病预防控制机构及早发现和追踪流感样病例暴发疫情的进展，对于尚未达到报告标准的暴发疫情，疫情发现单位也可尽早如实报告并及时进行网络直报。2．一旦实验室确定为流感等法定传染病疫情，所有实验室确诊和临床诊断病例均要进行个案网络直报，并在“突发公共卫生事件报告管理信息系统”中进行个案病例的关联。在“中国流感监测信息系统”中，承担检测工作的流感网络实验室负责录入疫情样本的实验室检测结果，进行网络直报该起疫情的疾控机构负责进行实验室样本的关联。3．在暴发疫情调查处理的进程中，疾病预防控制机构可以随时对“流感样病例暴发疫情监测报告表”(附表7)首次报告进行相应的更正。并按照《国家突发公共卫生事件相关信息报告管理工作规范（试行）》，做好进程报告和结案报告。（三）暴发疫情的调查处理1．流行病学调查接到疫情报告后，疾病预防控制机构应立即对疫情信息进行核实，开展现场流行病学调查，及时采取有效的控制措施，防止暴发疫情进一步发展，并为制订针对性的暴发控制措施、评估干预效果提供参考依据。具体内容包括：（1）核实诊断接到疫情报告后，各医疗机构及疾病预防控制机构根据流感样病例的诊断标准，对报告的病例进行核实诊断，确定流行或暴发的存在。（2）基本信息的收集内容包括暴发发生学校、集体单位、社区等人员分布情况、单位名称、地址、报告人、联系方式；暴发波及人数、教学/生产活动形式（如学校全日制、夜校和寄宿等）；学校、单位的班级、科室分布情况，地理地貌、居住条件、卫生条件等。（3）现场调查疾病预防控制机构应组织人员对报告的病例及时进行个案流行病学调查，调查内容包括：1）患者临床资料：根据“流感样病例调查一览表”（附表8），填写病人基本信息、主要症状、体征，病情、病程，检验结果（影像学、血液检测）；医生诊断或印象；流感疫苗接种史；病人隔离、治疗情况、效果和转归；2）患者流行病学史：与同类病例之间的接触史、与可疑动物的接触情况；3）该单位近2周因病缺勤情况及接触者健康情况；4）事件发生前一周及发生后单位内外集体活动情况；5）环境状况（通风、一般清洁状况、宿舍情况）；6）必要时收集其他影响传播的流行病学因素。根据疫情特点和疾病特征，对疫情的严重程度和发展趋势做出分析。（4）疫情追踪调查疫情处理期间，疫情暴发单位向属地县级疾病预防控制机构报告本单位每日新增病例数。疾病预防控制机构据此及时更新“流感样病例暴发疫情监测报告表”（附表7）。必要时，疾病预防控制机构对新发病例进行调查核实，及时并准确掌握和评