色谱柱分类与选择-内部培训资料

一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素色谱组分1906年俄国植物学家Tsweet发现色谱分离现象2高效液相色谱仪的分析原理高效液相色谱仪的结构色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱1Basicprincipleofchromatographicseparation1.1色谱分离基本原理PartitioncoefficientK分配系数硅胶颗粒基质合成步骤：•1.合成硅胶基质•2.键合配体(键合相)•3.端基封尾end-capped以传统方式制造硅胶色谱填料的过程:起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱），即A类硅胶90年代以后方式：organosilicapolymer有机单晶硅聚合的硅胶，即B类硅胶填料的端基封尾–封口残余硅羟基–减少不可逆吸附或拖尾–增加碳含量（0.1%-1%）C18键合并端基封尾后还能看见什么？硅羟基!—即使进行高密度键合，硅胶表面仍将残留约50%硅羟基(SiOH)!单、双、三官能团键合三官能团键合二官能团键合单官能团键合•键合常用封尾end-capped：三甲基硅氧烷极性封尾，增加极性保留HypersilODS即没有封尾HypersilODS-2有封尾由于空间位阻的存在，键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保留，导致峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三甲基氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减小这种影响，这种操作被称为封尾，封端，封口。•封尾封尾•空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷空间位阻极性嵌入polarembedded问题：下列色谱柱如何选择？•amidohexadecylsilylsilicagel•Column:—size:l=0.25m,Ø=4.6mm;—stationaryphase:diisopropylcyanopropylsilylsilicagelforchromatographyR(5μm)withaspecificsurfaceareaof180m2/gandaporesizeof8nm;•—stationaryphase:sphericaloctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(5μm)withaspecificsurfaceareaof170m2/gandaporesizeof12nm.•—stationaryphase:aminopropylsilylsilicagelforchromatographyR(5μm),•—stationaryphase:end-cappedoctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(5μm),•—stationaryphase:base-deactivatedoctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(3μm).•—stationaryphase:octylsilylbase-deactivatedsilicagelforchromatographyR(4μm)withaporesizeof6nm,•—stationaryphase:end-cappedpolar-embeddedoctadecylsilylamorphousorganosilicapolymerR(5μm);MobilephaseMix35volumesofacetonitrileRand65volumesofa5.23g/lsolutionofdipotassiumhydrogenphosphateRpreviouslyadjustedtopH7.0withphosphoricacidR.（答案见备注信息）以传统方式制造硅胶（A类硅胶）色谱填料的过程:起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱）Na2SiO3(矿物)+2H+Si(OH)4(silicicacid)+2Na+硅胶颗粒(含金属杂质!)C18/C8bonding+endcappingC18/C8ReversedPhases(最终仍带金属杂质!)与键合相的疏水性作用双重保留机理:1).与键合相的的疏水性作用;2).与残余硅醇基间的离子交换作用O-SiO-SiO-O-SiO-SiO-O-SiO-O-SiO-SiO-SiO-O--SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+当流动相pH值小于3时,硅醇基呈中性(未解离)BaseBase对碱性化合物的保留及严重拖尾两实验使用相同的传统C8硅胶柱离子交换作用碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理当流动相为pH6-8时,硅醇基带负电性(大部解离)既然pH3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离?低pH可导致分离选择性的完全丧失!AU0.000.020.04Minutes0.002.004.006.008.0010.00AU0.000.010.020.030.04Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.00pH7.0pH2.0amitriptylinenortriptyline硅胶晶格中杂质铝对硅醇基酸度的影响质子酸HOSiOAlOOSiSiOHHOOOOOSiSi金属嵌入硅胶晶格中，使硅醇基的酸性大大增强+_硅胶中金属杂质含量对螯合性化合物Hinokitiol峰形的影响Minutes2468流动相:20mMPhosphateBufferpH3.6（含0.05%EDTA):Acetonitrile(50:50)低金属杂质高金属杂质含量OOMn+OOSiSi金属杂质的存在可使得硅醇基过度活化，以至某些碱性化合物在酸性条件下仍呈现拖尾峰分析物:Chlorpheniramine杂质铝含量,ppm12340100200300400拖尾因子“高纯硅胶”区流动相:乙腈/KH2PO4pH3.0(20:80)传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响Minutes515253545AmitriptylineAcenaphthenePropranololandButylparabenNaphthalene铝杂质含量~375ppmTfUSP=6.5流动相pH7如何解决碱性化合物和螯合物的峰形问题?•从修饰流动相着手改善峰形(例如使用竞争性碱TEA或离子对色谱)–1970-1980年代策略•从改善反相填料着手降低硅醇基活性–自1990年代起至今现代色谱柱三大技术平台亲水AQ柱ECOSILODS-AQAtlantisDc18,T3SynergiHydro-RPHILIC柱Zic-HILICHypersilGOLDHILICAtlantisHILIC柱目的：提高极性化合物保留宽pH色谱柱ECOSILODS-ExtendXbridge/XterraC18/C8GeminiC18ZorbaxODS-Extend目的：提高色谱柱pH使用范围纯硅胶柱ECOSILODS-SHPurospherSTARRP18eSymmetryC18极性嵌入柱ECOSILODS-EPSZorbax-BonusRP18SymmetryshieldRP18目的：改善峰形Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)B类超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成过程无金属杂质的超纯起始原料常见品牌C18柱在pH7下的性能比较品牌Acenaphk'Amitrip/AcenapaAmitriptyline拖尾因子(美国药典法)EcosilC18-SH161.31.4InertsilODS-2161.42.5PuresilC18141.53.3ZorbaxRxC18161.86.0PurospherRP-18164.86.0KromasilC18AlltimaC1819231.53.59.413Nova-PakC18162.35.5NucleosilC18154.310HypersilODS112.810ZorbaxODS21无法测得结果!2.6常见品牌C18柱在pH3下的性能比较柱品牌Toluamidek'Chlorph/ToluamaChlorpheniramineECOSILC18SH1.43.41.2PurospherRP181.40.711.4AlltimaC182.43.21.8InertsilODS-21.72.91.9ZorbaxRxC181.43.32.0PuresilC181.63.62.9Nova-PakC181.33.9NucleosilC181.84.23.9ZorbaxODS1.74.94.6HypersilODS1.51111KromasilC181.53.61.8拖尾因子(美国药典法)对碱性化合物的峰对称性pH7pH3SymmetrySymmetry(极佳)InertsilPurospherLiChrospherRPselectBAlltimaYMCbasicInertsilPuresilkromasilPurospherYMCbasicZorbaxRxZorbaxRxNova-PakLiChrospherRPselectBkromasilPuresilAlltimaNova-PakNucleosilNucleosilHypersilZorbaxZorbaxHypersil(差)常见品牌柱在pH3和pH7下的峰形优劣排序EcosilODS-SHEcosilODS-SH具有极性嵌入基团的反相填料结构示意OSiCH3CH3极性基团极性嵌入基团键合配体OSiCH3CH3传统直链型烷基键合配体内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理水“屏蔽”层改善与水的浸润性－100%水溶液兼容降低了碱性化合物的保留降低了拖尾现象屏蔽了带负电的硅羟基CH3NH3CH+极性基团增加了表面层水的浓度01020304050用于浸润固定相的甲醇水溶液的比例%020406080100在1mL/min流速下的浸润率%C18键合相硅胶柱填料需要合适的湿润度注意：需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度,反之停流速后易出现“疏水塌陷”问题未湿润的孔湿润的孔注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，减少被分析物的保留时间即等于“疏水塌陷”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！低比例有机溶剂或纯水溶液流动相C18硅胶什么是“疏水塌陷”？分0246810流动相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被分析物没有保留“湿润时”“去湿后”疏水塌陷停流速后(孔去湿:~3%)流动相：0.1%醋酸水溶液Minutes0246810初始时保留时间无变化阿莫西林极性嵌入色谱柱：无疏水塌陷现象发生内嵌极性基团键合相：–使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定EcosilC18-EPSTfUSP=1.1分0102030阿米替林EcosilC18-SHTfUSP=1.4注意：对碱性化合物而言，可以减少保留时间并且改善色谱峰形相同硅胶基质(配体不同)内嵌极性基团的配体与直链烷烃配体的比较注:使用相同的流动相EcosilC8-EPSEcosilC8-SH选择性不同0102030-0.00200.0020.0040.0060.0080.010102030-0.00200.0020.0040.0060.0080.01minutesminutes呋喃唑酮(痢特灵)杂质分析极性基团嵌入技术（屏蔽技术）的历史沿革•1990:Supelcosil™pKb-100(嵌入酰胺键),专利(两步合成法)•1992:Prism®RP(嵌入脲结构)和Supelcosil™LC-ABZ(两步合成法)•1993:Supelcosil™ABZ+Plus(两步合成法)•1995/1996:WatersSymmetryShield™RP18/RP8(氨基甲酸酯结构),专利(一步合成法)•1999:WatersXterra™RP18/RP8(氨基甲酸酯结构),