单分子荧光共振能量转移技术

第23卷第11期2011年11月生命科学ChineseBulletinofLifeSciencesVol.23,No.11Nov.,2011文章编号：1004-0374(2011)11-1140-05单分子荧光共振能量转移技术赵永芳(哥伦比亚大学分子识别中心，纽约10032，美国)摘　要：单分子荧光共振能量转移技术(singlemoleculefluorescenceresonanceenergytransfer,smFRET)通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率，来研究分子构象的变化。在单分子探测技术发展之前，大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应(ensembleaverages)，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。单分子探测可以对体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可研究生物分子的动力学反应。介绍了近来单分子荧光共振能量转移技术的进展。关键词：单分子；荧光共振能量转移；荧光基团中图分类号：Q3-3；TG115.33文献标志码：ASinglemoleculefluorescenceresonanceenergytransfertechniqueZHAOYong-Fang(CenterforMolecularRecognition,ColumbiaUniversityCollegeofPhysiciansandSurgeons,NewYork10032,USA)Abstract:Singlemoleculefluorescenceresonanceenergytransfer(smFRET)methodwasusedtodetecttheconformationalchangesbydetectingtheenergytransferefficiencybetweendonorandacceptorinsinglemolecule.Beforethedevelopmentofsinglemoleculedetectionmethod,mostofthemolecularexperimentwasdonebyensembleaveragesmethodwhichlostlotsofspecialinformation.Singlemoleculedetectioncananalyzethesinglemoleculeinthesystem,getthehistogramdistributionofthemoleculesandalsoanalyzethekineticsofthebimolecularreaction.Thisreviewdescribedtherecentprogressofsinglemoleculefluorescenceenergytransfertechnique.Keywords:singlemolecule;fluorescenceresonanceenergytransfer;fluorescencefluorophore收稿日期：2011-06-16通信作者：E-mail:[e-mail]1　单分子荧光技术单分子科学作为一门新兴边缘学科，给生命科学领域研究带来了蓬勃生机，使人们能更深刻地了解复杂的微观生命过程。单分子荧光技术在生物及化学领域取得了惊人的发展，让实时监测单个生物分子或分子复合物变得可行，大大扩展了对生物大分子复杂的动力学过程的表征能力[1-4]。在单分子技术出现之前，分子生物学实验结果往往只代表测量时间内大量分子的平均行为，而生物体系一般是不均一的体系。因此，监测单个分子的行为具有重要的意义。当单个荧光基团(fluores-cencefluorophore)标记到目标分子后，它能在多方面去探测目标分子。首先，通过荧光成像技术可以了解目标分子在细胞内的空间分布[5-6]，也可以应用荧光强度[7]以及极性的变化[2]来检测目标分子的运动及活性情况。当一个分子或两个相互作用的分子上标记两个不同的荧光基团后，一个是在能量转移过程中提供能量，即供体D(donor)；另一个接受能量，即受体A(acceptor)。这样可以运用荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技术[3]来对体系进行研究。因此，比单个荧光基团标记更具有优势，称为单分子荧光共振能量转移(singlemoleculefluorescenceresonanceenergytransfer,smFRET)技术。smFRET近年来迅猛的发展，在研赵永芳：单分子荧光共振能量转移技术第11期1141究蛋白质折叠和构象变化[8]、RNA折叠和催化[9-10]、膜融合蛋白和肌动蛋白的运动[11-12]，以及信号转导[4]等方面相当有效。荧光供体及受体之间的FRET可以用来测量两个荧光基团之间的距离。能量转移的效率E，是荧光受体的荧光强度与所有荧光强度(受体和供体的荧光强度之和)的比值[3,13]。同时，E=[1+(R/Ro)6]-1，其中R是荧光供体和受体之间的距离，而Ro是E为0.5时两荧光基团之间的距离(即Forster半径)。单个生物分子的构象变化就能通过smFRET进行实时监测。FRET技术的优点在于其用荧光强度的比值，而不是荧光的强度，这样实验的结果不会受仪器本身的噪声影响而强烈波动。2　smFRET的特点单分子技术的优势使其在生物领域受到极大的青睐。例如在不均一的体系中，单分子技术能直接反映分子特性的分布状态。此外，在复杂的生物化学反应中，单分子技术能够在不同步化每一步反应的情况下研究每一步的动态化学反应[3,13]。2.1　smFRET研究群体的分布状态当单个生物分子的FRET值确定后，可以通过FRET值的分布作出生物分子的统计图[14]。这种方法不局限于smFRET技术，还有其他的方法也能达到这一目的。可以假设有一个不均一的样品，包含两个不同的群体，每一个群体有不同的FRET值。传统的整体稳态FRET测量只能得到单一的FRET值，即整个样品的平均FRET值，但是它不能反映出样品的不均一性。而smFRET方法通过生物分子的统计图能很直观的检测出样品的群体分布状态，以及每一个群体的FRET值(图1A)。2.2　smFRET研究生物分子的动力学反应对于生物化学反应，如果想用整体FRET来研究动力学反应，得出反应的动力学参数，需要用各种方法来使反应同步化，使每一个分子处于反应的同一状态，然后在外加的因子下启动反应。如果反应无法同步化，整体FRET的方法就无法对反应的动力学进行研究。但是smFRET并不受生物化学反应同步化的限制(图1B)。同时smFRET还能探测到稀有的构象变化以及非富集中间产物的形成[15]。这些是很难用整体FRET检测到的。3　smFRET的实验设计smFRET技术的发展与相关领域的发展是分不开的，长期以来由于信噪比太低，使smFRET技术不能广泛地应用。最近20年来，由于在显微技术、荧光染料以及照相技术上突破性的发展，使得smFRET得到迅猛的发展。首先，全内反射荧光显微镜(totalinternalreflectionfluores-cencemicroscope,TIRFM)[16-17]以及减少激发体积的显微技术(运用共聚焦或双光子显微镜)[18-19]的发展，使背景噪声降到最低，大大提高了信噪比；其次，人们对荧光染料的改进，使得荧光染料的亮度及光学稳定性得到极大的提高；再次，低温电荷耦合器(chargecoupleddevices,CCD)取得突破性的进展，在提高量子效率的同时，还提高时间分辨率，使其达到毫秒级别。显微镜的物镜(高数值孔径(NA)，高放大率，低像差)及激光技术(高稳定性，多个波长)的发展也推动了smFRET的发展。3.1　用于单分子荧光的染料运用于单分子荧光技术的染料需具备以下几个条件[3]：(1)光稳定；(2)亮度高(高消光系数及高发射量子效率)；(3)低荧光强度波动性(至少在所研究的生物事件的时间分辨范围内，荧光强度的波动小)；(4)激发波长及发射波长在可见光的波长范A,LeuT在无Na+的条件下，smFRET能检测出两个FRET的峰，而整体FRET的方法只能得到平均的FRET值(虚线)；B,smFRET能检测到单个LeuT分子构象间的转化，进而得到分子动力学参数，这些信息很难应用整体FRET的方法得到。图1smFRET能检测不同的构象生命科学第23卷1142围内；(5)容易获得，可以方便购买，并对生物分子进行标记。另外，适合smFRET的一对荧光基团还需具备以下的性质：(1)光谱重叠低，这样能降低供体的发射波长与受体的发射波长的重叠，同时也能减少受体直接受激光的激发；(2)供体和受体的发射量子效率具有可比性。第二个条件能保证在FRET值变化的时候供体和受体的荧光强度的反相关性。荧光蛋白[20-22]、有机染料[13,23]以及半导体量子点[24-25]在单分子荧光技术上均有应用。荧光蛋白具有较低的光稳定性，在单分子技术上它的应用不如有机染料广泛。有机染料由于其相对分子质量小，光稳定性强，以及多种形式的有机染料可以很容易购得(例如Cyanine系列的染料可以从GEHeal-thcare购得)，因此其应用最为广泛。其中，长期以来一直广泛应用的是Cyanine染料系列中的Cy3及Cy5。半导体量子点也可作为荧光的供体用于单分子荧光技术上。目前商品化的半导体量子点的直径大于20nm，远大于有机荧光染料分子(直径小于1nm)。如此大的体积，使其在smFRET中检测生物分子的构象变化上不够灵敏。另外，单官能的半导体量子点目前尚未商品化。但是JacobPiehler实验室[25]及AliceYTing实验室[26]报道了单官能的半导体量子点的制备及在单分子荧光技术上的应用。由于其光稳定性远强于荧光蛋白及有机荧光染料，半导体量子点作为一种新型的荧光探针正越来越广泛地被采用。3.2　样品的制备及单分子的检测单分子荧光FRET可通过激光共聚焦显微镜及全内反射荧光显微镜来实现。对于激光共聚焦显微镜，通过高数值孔径物镜来聚焦激光，有效地减少了激发体积。因此，背景信号很低，可以满足单分子荧光的检测。激光共聚焦显微镜可用于表面固定化的生物分子，同时也可用于自由扩散的生物分子的单分子检测。其通常运用迅速灵敏的点检测器来收集光子信号，如雪崩光电二极管，可以达到皮秒级的时间分辨率。目前已有商品化的用于单分子荧光技术的激光共聚焦显微镜，如PicoQuant公司的MicroTime200。激光共聚焦显微镜[27-28]在检测荧光分子之间距离的群体分布上非常适用。如果需要监测单个分子的构象在毫秒到分钟范围内变化时，通常运用全内反射荧光显微镜来观察表面固定化的生物分子以达到高通量的样品监测。使用广视野检测的全内反射荧光显微镜在单分子应用中更为广泛。光通过棱镜或高数值孔径物镜进行全反射后产生激发渐逝场，能选择性地激发靠近固定化表面的分子(~100nm)。因此，降低了背景信号。在检测表面固定化的生物分子或追踪分子的横向运动上，全内反射荧光显微镜是理想的选择，其通常选择使用电荷耦合器件(CCD)作为探测器的摄影机来收集信号，这样可以同步监测数构象的变化并达到毫秒级的分辨率[29-30]。现在有多种商品化的荧光染料，使得生物分子的标记大大简单化，如对于核酸分子的标记，含有亚磷酰胺基团的染料能很容易地在核酸合成的过程中标记核酸分子；也可以用氨基反应性的染料标记核酸合成过程中产生的氨基，然后通过分子筛、高效液相色谱或凝胶电泳将染料标记的核酸分子与游离的染料及无染料标记的核酸分子分开。由于赖氨酸在蛋白质表面的富集性，通常使用氨基反应性的染料对蛋白质或抗体进行标记。对于大多数蛋白，由于表面含有多个赖氨酸，此方法对于位点特异性的标记并不可行，此时可以选择半胱氨酸。半胱氨酸在蛋白质表面并不常见，可以使用巯基反应性的染料对蛋白进行位点特异性地标记。如果要较长时间使用smFRET技术观察生物分子的构象变