血细胞分析仪原理

第三章血液分析仪检查目的要求1、掌握：血液分析仪各项参数的缩写、参考值、直方图概念。2、熟悉：血液分析仪电临床应用、检测参数、方法学平价、血细胞直方图正常形态特点及常见异常形态、临床应用。3、了解：血液分析仪的进展。重点:1、血液分析仪测定的原理、方法2、血液分析仪各参数临床意义难点:血液分析仪检验的质控§1血液分析仪的发展史自动血液分析仪（automatedhematologyanalyzer,AHA)，早年称血细胞计数仪（bloodcellcounter)，是目前国内外临床检验最常用的筛检仪器之一。1、传统采用手工方法2、20世纪50年代，美国的Coulter设计了第一台电子血细胞计数仪。还产生了血红蛋白仪。3、20世纪70年代检测血小板的仪器Baker-8104、20世纪80年代，可打印WBC、RBC、PLT体积分布直方图。5、20世纪90年代，白细胞分类的开发（二分类、三分类）；将网织红细胞检测技术用于血细胞分析仪；生产了血液学全自动系统。6、现在，白细胞五分类，仪器组合化血细胞分析仪近年来的发展变化1.血常规检验多参数化2.多功能合成扩展3.检测速度的提高4.方法的改进和进展5.应用的方便性血液分析仪功能：①全血细胞计数功能。②白细胞分类功能。③扩展功能。血液分析仪优势检测项目多速度快精度高易操作§2检测原理检测原理电学光学电阻抗法射频电导法激光散射法分光光度法一、电阻抗法血细胞计数原理即库尔特原理（Coulterprinciple):根据血细胞非传导的性质，以电解质溶液中悬浮的血细胞在通过计数小孔时引起的电阻变化进行检测为基础，进行血细胞计数和体积测定。小孔管是电阻抗法细胞计数的一个重要组成部分。检测期间，当电流接通后，位于小孔两侧的电极产生稳定的电流。如果供给的阻抗也是稳定的，则小孔的电压是不变的。当有一个细胞通过小孔时，由于电阻增加，于瞬间引起电压变化——通过脉冲。细胞体积越大，脉冲振幅越高；细胞数量越多，脉冲数量也越多。脉冲信号经过下列步骤，得出细胞计数结果：1.放大由于血细胞通过微孔时产生的脉冲信号微弱，必须通过放大器将讯号放大。2.阈值调节在一定范围内调节参考电平的大小，使计数结果尽可能符合实际。3.甄别利用甄别器根据阈值调节器提供的参考电平，将低于参考电平的假讯号（细胞碎片，杂质微粒）去掉。4.整形通过整形器作用，将脉冲讯号波形修整成一致标准的平顶波，才能触发电路5计数血细胞的脉冲信号，经过放大、甄别、整形后，送入计数系统，得出计数结果。电阻抗法可准确测量出细胞（或类似颗粒）的大小，是三分群血液分析仪的主要应用原理，并与光学检测原理组合应用于五分类血液分析仪中。三分群血液分析仪基本组成①信号发生器各种微粒通过检测小孔产生电阻抗脉冲信号的检测源。②放大器将血细胞微弱脉冲信号放大以触发电路系统。③阈值调节器调节能区分不同群细胞合适的信号电平。④甄别器去除非参考电平的各种假信号以提高计数的准确性。⑤整形器将不一致的脉冲波形信号调整为标准的波形后触发计数电路系统。⑥计数系统将整形后的血细胞脉冲信号显示为不同类群的细胞数。二、激光散射法激光散射法应用了流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测原理。流式细胞术检测原理：细胞通过激光束被照射时，产生与细胞特征相应的各种角度的散射光。对经信号检测器接收的散射光信息进行综合分析，即可准确区分正常类型的细胞。半导体激光的流式细胞术侧向荧光（RNA/DNA含量）激光（波长633nm）侧向散射（细胞内部结构，如核的大小）前向散射光（细胞大小）低角度散射光（前向散射光）：反映细胞的数量和表面体积大小。高角度散射光（侧向散射光）：反映细胞的内部颗粒、细胞核等复杂性。激光散射法在区别体积相同而类型不同的细胞特征时，比电阻抗法分群更加准确。故激光散射法已成为现代五分类血液分析仪的主要检测原理之一。流式细胞仪的技术特点流式细胞仪在设计上采用了许多独特的技术，比如液流系统、光路系统、信号测量和细胞分选方面都有自己的技术特点。着重讲述液流系统——鞘流原理。雷诺系数ReRe＝dρν/ηd:管子的直径ρ：液体的密度ν：液体的流速η：液体的粘滞系数Re2300，液流处于稳流状态Re2300，液流处于湍流状态通常把标本流的流速控制在10m/s以内，就能保持标本流处于稳流状态。外面包被有高速流动的鞘液，实现标本与鞘液稳定的同轴流动状态。同时利用液流聚焦原理，使标本流直径变小，通常只有10～20μm，避免细胞多个重叠进入检测区。激光散射法系统基本组成1、光源气体（氦－氖）激光或固体（半导体）激光（单色光）；钨光源（多色光）。2、鞘流维持颗粒于液流中央，顺序、单个、恒速向前流动，即流体动力学聚焦。3、细胞悬液被检测细胞（颗粒）的悬液，由气压导入流动池。4、光检测器接受来自各种角度的散射光或吸收光信号，并转换成相应特征的电信号三、射频电导法射频（radiofrequency,RF)指射频电流，是每秒变化大于10000次的高频交流电磁波。高频电流能通过细胞壁。用高频电磁探针渗入细胞膜脂质可测定细胞的导电性，提供细胞内部化学成分、细胞核和细胞质、颗粒成分等特征信息。四、分光光度法Lambert-Beer定律：A=lg(I0/I)A:吸光度，或称光密度；I0：单色入射光强度；I：透过光强度分光光度法仪器的组成：单色光源、检测池和比色容器、光检测器。分光光度法是所有类型的血细胞分析仪检测Hb的原理：被稀释的血液加入溶血剂后，红细胞溶解，释放血红蛋白，后者与溶血剂结合形成Hb衍生物，在特定波长（530～550nm）下比色，吸光度的变化与液体中Hb含量成比例。血红蛋白血红蛋白衍生物吸光度Hb浓度溶血剂λ＝540nm血红蛋白测定的溶血剂溶血剂含氰化物的溶血剂不含氰化物的溶血剂§3血液分析仪检测参数原理不同类型血液分析仪检测参数的原理不尽相同。高档仪器应用2种或2种以上检测原理，组合电学、光学、细胞化学等技术，在独特检测通道测定红细胞、血小板和白细胞系列的数量、亚类及相关参数。一、白细胞系列参数检测原理仪器将体积为35～450fL的血细胞，分为256个通道（channel）。每个通道：1.64fl。根据细胞大小，分别置于不同的通道中，显示血细胞体积分布直方图(Histogram)。（一）电阻抗法1.分群经溶血素处理脱水后，血细胞体积大小发生了变化！！！第一群（35～90fl）小细胞区：淋巴细胞（体积最小）。第二群（90～160fl）单个核细胞区，（中间细胞）：单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原始、幼稚细胞、异常细胞等。第三群（160fl以上）大细胞区：嗜中性粒细胞（体积最大）。2.白细胞分布直方图三分群血液分析仪正常白细胞分类模式图（直方图）3590160300400450(fl)%（二）光散射法白细胞分类1.体积、电导和光散射法（volume,conductivity,lightscatter,VCS)VCS电阻抗技术细胞大小和内部结构细胞内的颗粒性、核分叶性和细胞表面结构体积电导光散射2、电阻抗与射频法（能透入细胞内，测量核的大小及颗粒的多少）。RF:射频电流细胞内部结构信息DC:直流电细胞大小的信息（1）嗜酸性粒细胞检测系统专用的E溶血剂，电阻抗法（2）嗜碱性粒细胞检测系统专用的B溶血剂，电阻抗法（3）淋巴、单核和粒细胞检测系统电阻抗和射频联合检测（4）幼稚细胞检测系统电阻抗法成熟幼稚成熟幼稚膜上脂质少膜上脂质多加入溶血剂结合AA多结合AA少加入硫化AA幼稚保持完整细胞破坏3、多角度偏振光散射法（MAPSS)（1）白细胞计数用含DNA染料碘化丙啶试剂可破坏有核红细胞膜和细胞质，只留下细胞核，裸核易于染色。染料对有活性的白细胞只有极小渗透性或无渗透性，故不出现细胞核染色。从而鉴别有核红细胞和活性白细胞，计算活性白细胞比率。（2）白细胞分群MAPSS0°,前向散射光：细胞大小、数量7°，侧向散射光：细胞内部结构及核染色质的复杂性90°，垂直角度散射光：细胞内部颗粒及分叶状况90°D，垂直角度去偏振散射光，鉴别E与NMAPSS法可鉴别白细胞亚群、异常细胞类型，白细胞分类不受有核红细胞、血小板凝聚、未溶解红细胞和细胞碎片等干扰物质影响。运用这类原理的血细胞分析仪：SF-3000、CD-3500、MEK-8118K、Diana-5和EXCELLTM-22等。4、激光与细胞化学技术联合应用（1）过氧化物酶（Peroxidase,Perox)染色通道过氧化物酶活性强度：ENM,L和B则无。（2）嗜碱性粒细胞/核分叶性（baso/lobul-arity)通道:除B外其他细胞仅剩裸核，不同细胞的裸核结构不同，分叶越多散点越靠近横轴右侧，根据多分叶核和单个核的比例，可计算出左移指数。（3）未染色大细胞计数检测5.双鞘流动力连续系统(DHSS)用钨光源流式细胞光吸收、化学染色和电阻抗法①WBC计数通道：电阻抗法②嗜碱性粒细胞通道：专用染液③WBC分类通道：双鞘流系统中，用流式细胞光吸收、电阻抗和细胞化学染色液联合检测除B以外的WBC。DHSS技术：在流式通道中有2个鞘流装置，细胞经第1束鞘流后通过阻抗微孔测定细胞的真实体积，然后经第2束鞘流后到达光窗，测定细胞的光吸收，分析细胞内部结构。二、成熟红细胞系列参数检测原理1、红细胞数和红细胞比积：原理通WBC计数红细胞体积分布直方图（一）电阻抗法2、血红蛋白含量测定分光光度法3、各项红细胞平均指数检测根据RBC、HCT和HGB换算出来。4、红细胞体积分布宽度（RDW）不同大小的脉冲信号分别贮存在仪器内装计算机的不同通道，计算出相应的体积及细胞数，经统计处理得到RDW。（二）流式细胞术光散射法1、光散射法红细胞、血红蛋白检测原理低角度(2°～3°)：测量红细胞体积。高角度(5°～15°)：测定红细胞血红蛋白浓度。2、红细胞散点图是红细胞体积与血红蛋白浓度二维散点图，反映光散射与细胞体积和血红蛋白浓度之间的相互关系，能准确区分小红细胞等异常。线性体积/血红蛋白浓度（V/HC)散点图分为9个区。三、血小板系列参数检测原理（一）电阻抗法血小板计数（platelet,PLT）：随红细胞在一个系统中进行检测。直方图在2～28fl（不同仪器不一）。%102030(fl)（二）激光散射法根据Mie同质性球体光散射理论，球形化PLT通过激光照射区时，在高角度得到PLT折射指数（refactiveindex,RI)，与PLT密度有关（PLT:1.35~1.40,RBC:含有高浓度Hb，RI为1.35~1.44）；低角度得到血小板大小。此法可区分PLT和红细胞。（三）流式细胞激光核酸荧光染色和电阻抗法红细胞/血小板计数通道电阻抗法结果异常时，转换至光学法核酸荧光染色网织红细胞/血小板检测通道。通过核酸荧光染色鉴别网织Plt、成熟Plt和成熟RBC.（四）固体激光散射法、电阻抗法和单克隆抗体荧光染色散射法四、网织红细胞系列参数检测原理（一）非荧光染料染色法用新亚甲蓝对网织红细胞RNA染色，采用VCS技术测定Ret。此外，应用柔变轮廓分析技术，以非线性方式区分红细胞群和成熟红细胞群。（二）荧光染料染色法（1）用聚次甲基染RNA和恶嗪染DNA法（2）用氧氮杂芑750染RNA法（3）用非对称菁荧光染料染RNA法。（4）用噻唑橙染网织红细胞RNA法。五、有核红细胞系列参数检测原理1.VCS法2.流式激光/荧光染色法（1）聚次甲基荧光染色法（2）碘化丙啶染色法3.白细胞计数和分类通道衍生法4.阻抗法和噻唑橙荧光染色流式细胞术六、血细胞分析仪工作流程（电阻抗法）§4血细胞分析仪的类型根据对白细胞分析程度分为二分群、三分群、五分类。根据自动化程度又分为二大类：半自动仪器须手工稀释标本；全自动仪器可直接用抗凝血进样。一、半自动二分群血细胞分析仪①检测速度为60个/h,仪器为双通道，容易操作。②用血量少，准确性、重复性好。③测量结果超过正常界限和直方图不正常，可出现警示符号提示。1.仪器性能④有质控资料及标本检测资料贮存、手工鉴别、设备警告等软件程序。⑤