第十二章 现代生物技术与家畜育种

第十二章现代生物技术与家畜育种学习要求：1.掌握生物技术的概念、了解其作用和意义2.掌握四种现代生物技术的原理及方法第一节生物技术的基本概况一、生物技术的产生与发展生物技术是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物作反应器将物料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。年代事件1917KarlEreky首次使用“生物技术”这一名词1943大规模工业生产青霉素1944Avery,Macleod和McCarty通过实验证明DNA是遗传物质1953Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构1961~1966遗传密码破译1970分离出第一个限制性内切酶1973Boyer和Cohen建立了DNA重组技术1976第一个DNA重组技术规则问世1976DNA测序技术诞生1978Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1980第一台商业化生产DNA自动测序仪诞生1982第一个转基因动物诞生1983基因工程Ti质粒用于植物转化1988PCR方法问世1985~1990许多分子生物技术出现1997英国培育出第一个克隆羊多莉1998日本培育出克隆牛，英美等国培育出克隆鼠二、动物育种技术及其发展现代生物技术发展史上一些重要事件年表ed三、动物育种中的现代生物技术2006年1月11日，美国科学家宣布培育出了世界上首只转基因猴“安迪”，为人类最终战胜糖尿病、乳腺病、帕金森氏症和艾滋病等顽症提供帮助。I’mAndy.转基因斑马鱼，会在特别的光照下发出不同的光芒胚胎移植第二节转基因动物技术一、转基因动物的概念转基因动物技术是将外源DNA导入性细胞或胚胎细胞并生产出带有外源DNA片段动物的一种技术。二、转基因动物技术的一般步骤生产转基因动物的步骤包括：(1)选择能有效表达的蛋白质；(2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因；(3)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基因调节序列；(4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细胞或小鼠中预先检验其表达情况；(5)把拼接的基因引入到受精卵的细胞核中；(6)把引入后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发育；(7)检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达情况以及外源基因在其后代中的传递情况。部分后代细胞携带有转入的外源基因，利用这些动物培育新的品系。三、导入基因的方法(一)显微注射法(二)精子载体法(三)胚胎干细胞(ES)介导法(四)染色体片段显微注入法(一)显微注射法人们已利用显微注射法将胸苷激酶基因、生长激素基因和鼠myc基因转入了哺乳动物细胞。这种方法不仅可以获得转基因动物所用的转基因动物细胞，而且也可以通过哺乳动物细胞来生产有用的蛋白质。(目前认为胃癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、何杰金氏病及头部肿瘤等都有myc基因的扩增或过度表达)小鼠和兔的受精卵原核在普通显微镜下容易看到，而绵羊，尤其是猪和牛的卵细胞质稠密，不能看到原核。Hammer等用干涉相差显微镜可观察到80％的绵羊卵核，而猪和牛的卵子需经离心处理再用干涉相差显微镜才能观察到卵原核，离心处理后的多数受精卵仍能正常发育。(二)精子载体法方法：将成熟的精子与带有外源DNA的载体进行共培育之后,使精子有能力携带外源DNA进入卵中，使之受精，并使外源DNA整合于染色体中。Bracet等(1971)将家兔精液和放射性标记的SV40病毒DNA孵育后，在精子头部能够检测到放射活性，病毒DNA在受精过程中被带入了卵细胞。Lavitravo等(1989)把质粒与小鼠的附睾精子共孵育30min，进行体外授精和移植，结果获得250个后代中，30％的为阳性，部分小鼠表达了CAT基因并传到F1代。这一方法在转基因鼠上的应用使人们看到转基因动物效率提高的希望。影响DNA与精子结合的因素可能是获得成功的关键性因素，首先哺乳动物精子吸附外源DNA需特定的时期；其次精子吸附DNA时精子活性及DNA性质都受影响。利用精子作为基因转移的工具，在实践中存在许多问题，但此技术至少在构思上对于大动物转基因研究具重要意义。(三)ES细胞介导的转基因动物生产胚胎干细胞(embryonicstemcell)是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团的细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞注入寄主胚泡后，参与胚胎形成，进入嵌合体动物的生殖系统。用DNA转染法或反转录病毒介导法可将基因导入胚胎干细胞，选出带有目的基因的细胞克隆，然后导入受体胚胎。由此法生成的后代都是嵌合体，若由这些嵌合体胚胎中再分离出干细胞，用核移植技术将其细胞核植入无核卵细胞，这样可以提高转基因的效率。生物学中嵌合体是指同一个体中不同基因型的组织相互接触而存在的现象。以噬菌体或病毒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程2007年3月24日英国《每日邮报》报道说，美国内华达大学教授伊斯梅尔·赞贾尼历经７年研究，最终利用向绵羊胚胎注射人体干细胞的技术，成功培育出一只含有１５％人体细胞的绵羊。科研人员首先从人体骨髓中提取干细胞，然后将干细胞注入胎羊的腹膜中，这样人体细胞就会通过新陈代谢和循环系统进入胎羊体内各个器官。羊羔降世两个月后，就会长出含有人体细胞的肝、心脏、肺等器官。（四）染色体片段显微注入法染色体介导法是指从人或动物染色体上割取特定的染色体片段(M期)或分离出来之后，以其为媒介将外源基因注入动物早期胚胎中，以获得外源DNA的动物，严格地讲称为转染色体动物。通常人们采用离心分离法或流式细胞仪(fowcytometry)分离法分离染色体。尽管目前该技术应用困难较大，且成功率很低(0～0.002％)，但由于它具有不需经基因重组就可转移超大型外源DNA(大于1000kb)之独特优点，适于多基因转移。鉴于本法导入的遗传信息片段长，能生产出具备某些特殊疾病的实验动物模型。四、基因的选择与转基因动物的研究现状1.转入基因的选择目前在动物转基因的选择上主要包括四大类：(1)与机体代谢调节有关的蛋白基因，这类基因参与机体组织生长发育的调节，如生长激素基因等；(2)抗性基因；抗逆、抗病等；(3)经济性状的主效基因，如猪和绵羊的高繁殖力基因、肉牛的“双肌”基因等，这些基因与动物的生产力密切相关；(4)治疗人类疾病所需的蛋白质基因，以拓宽动物的经济用途。(1)提高动物生长、生产性能的研究美国伊利诺斯大学研究出一种带牛生长激素的转基因猪，这种猪生长快,体大,饲料利用率高，可给养猪业带来丰厚的经济效益。Bawden的研究小组1995年报道了成功地在转基因小鼠和绵羊中表达了细胞半胱氨酸生物合成基因，以此尝试改良羊毛的生长。半胱氨酸是羊毛合成的限制性氨基酸。1995年，BullockD.W.生产的转类胰岛素IGF－I的基因羊的羊毛产量得到了提高。1996年,新西兰科学家Damak等将小鼠超高硫角蛋白启动子与绵羊的IGF－IC13AJA融合基因显微注入绵羊原核期胚胎，培育出的转基因羊，其净毛平均产量比非转基因羊提高了6.2%。2.转基因动物的研究现状(2)改变奶蛋白成分和性质的设想在奶牛和奶羊上，转基因的主要途径是改变乳的成分、提高产乳量和生长速度。例如转入一个超量表达的K酪蛋白基因能够增加酪蛋白的产量。通过胚胎基因转移技术导入原有基因的额外拷贝、采用某些奶蛋白高水平表达基因的调节序列以及转移另一物种的奶蛋白基因或修饰基因，可以改变原有奶蛋白的成分和性质，如把人奶蛋白产物引入家畜奶中，以这种家畜的奶替代人奶，或增加牛奶中某些蛋白质的浓度，改变牛奶加工处理的性能等，目前分离出改变奶成份的有关基因。(3)利用家畜生产药物蛋白的研究htPA(人组织型纤溶酶原激活剂)五、转基因动物的应用前景应该看到，今天人类在转基因动物方面所取得的成果还仅仅处在起步阶段。随着生命科学各个领域的不断发展，新的突破会不断产生，一些在实验室中获得的结果可以不断地运用到生产实践中去。例如，澳大利亚、新西兰、南非、英国等主要产羊毛国家目前正在致力于开发一种可以生产彩色羊毛的高产的转基因羊。类似的设想还很多，相信在未来，人们可以创造出更多有良好经济效益的物种，使地球的生物圈变得更加丰富多彩。转基因技术的诞生、成熟和推广正在给养殖业带来一场新的革命。转基因存在的问题1.成本高，但是成功率低按供体进行超排，获取受精卵计算生产一头转基因猪$2.5万,生产一头转基因牛$50万。2.转基因整合和表达效率低3.转基因的遗传率低转基因动物及其后代并不能够保证外源基因世代传递，外源基因很容易从基因组中丢失。ATA(G0)×ATA(G0)ATA(G0)×AA(非转基因动物)↓↓ATAT:2ATA:AA=1:2:1ATA:AA=1:1OEO222理论上：转基因动物为75%50%实际上:30%15.2%通过检验，差异极显著。4.存在与预期结果不相符的现象原因：(1)物种间的差异同一种疾病在不同的物种发病机制可能不同。(2)物种体内有复杂的调控和平衡机制，单一外源基因对动物整体的作用可能有限。(3)转基因的整合、表达和调控不能达到真正人为控制。5.转基因产品制备导致了一些社会问题主要是产品的安全问题。第三节动物克隆技术一、动物克隆的概念所谓克隆(cloning)就是无性繁殖，动物克隆(animalcloning)就是不经过受精过程而获得动物新个体的方法。克隆动物(cloninganimal)就是指不经过生殖细胞而直接由体细胞获得新的动物个体。然而研究人员对克隆的具体定义仍存争议，有些人认为凡是不经过受精过程而获得新个体的方法叫克隆；而另一些人则认为只有像在植物中那样，从一个具有全能性的体细胞直接再生出新个体才能叫克隆。但在目前的技术水平条件下，所有的高等动物体细胞都必须将其遗传物质转入卵细胞或原核胚后才能再生，也就是说，必须借助于卵细胞或原核胚的细胞质中的某些特殊物质才能进行正常的生长发育，而不能从体细胞直接再生获得新的个体。因此，按照后一种说法现在的所谓“克隆”动物其实都不是真正意义上的克隆。然而，目前人们所接受的克隆动物实际上是前一种比较宽松的克隆定义。克隆动物技术实际上是结合采用了核移植与胚胎生物工程技术。其操作步骤大体为：1）体细胞的采集和培养；使已失去全能性的体细胞恢复全能性；2)采集卵细胞并去除卵细胞的细胞核；3）取出体细胞的细胞核；4)用微注射法注入去除核的卵细胞中去；5)将重组胚细胞在体外进行适当培养；6）将转核胚置入同期母体子宫，完成发育，所产生的动物幼子为克隆动物。二、克隆动物的一般步骤克隆动物操作的一般步骤三、影响动物克隆的因素细胞融合的条件细胞发育阶段可对核移植实验产生影响细胞诱导分裂成熟因子(MPF)的活性卵细胞中的大分子物质的影响四、克隆动物的意义与前景1.可以用于动物资源的种质保存，可尽可能多地保存地球生物圈内的多样性。2.可以生产移植器官、利用动物作生物反应器生产药物和提供实验动物，造福人类。还可以通过克隆哺乳动物某些特定发育阶段的胎儿，对人类的某些顽症实施“细胞治疗”。3．可以克隆家畜和濒临灭绝的动物，如大熊猫等。4.利用哺乳动物体细胞克隆技术，可通过建立转基因体细胞系的方式，克隆转基因动物。体细胞克隆技术生产转基因动物，体细胞克隆中所生后代全都携带外源基因，可望降低生产成本。5.体细胞克隆技术可以直接把优良物种特性传递下去,培育优良物种,有助于缩短育种年限,加速动物育种进程,提高育种效率。第四节胚胎生物工程技术胚胎生物工程技术包括鲜胚和冻胚移植、胚胎分割、胚胎冷冻、冷胚切割、体外受精、胚胎干细胞培养、分离与克隆等技术，在国外已进入实用性阶段。MOET育种技术就是在此基础上而产生的一种新的家畜育种技术，即主要是利用超数排卵、人工授精、胚胎移植等生物工程技术来加快遗传进展和良种培育速度。胚胎干细胞培养、分离与克隆技术的成功在胚胎工程中具有重要意义，它能够有效解决胚胎细胞的来源。一、冷冻精液与人工授精技术人工授精是利用器械采集公畜的精液，经检查和处理后，再用器械将精液输入到发情母畜的生殖道内,以代替公、母畜自然交配而繁殖后代的一种技术