第二章基因工程工具酶

第二章基因工程工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶第一节限制性核酸内切酶一、限制性内切核酸酶的概念限制性内切酶（restrictionendonuclease）简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。限制性酶是从原核生物中提取的现已在300多种微生物中发现600多种限制性酶二、宿主的限制和修饰现象1.实验大肠杆菌K大肠杆菌Bλ.Kλ.BEOP=10-4EOP=10-4EOP=1EOP=1图2-1大肠杆菌宿主控制的限制与修饰体系注：①图中数字表示生长在不同宿主的λ噬菌体的成斑率（efficiencyofplating，EOP）②λ.K表示在E.coliK菌株上生长的λ噬菌体；λ.B表示……..2.限制-修饰作用的分子基础研究发现,限制-修饰系统与三个连锁基因有关:hsdR：编码限制性内切核酸酶，这类酶能识别DNA分子上的特定位点并将其切断。hsdM：编码产物是DNA甲基化酶，这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，起到修饰DNA的作用。hsdS：它的表达产物是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。43.生物学功能一是保护自身DNA不受限制；二是破坏入侵的外源DNA防御异源遗传信息进入体内。因此，在基因工程中，常采用缺少限制作用的菌株作为受体，以保证基因操作的顺利完成。三、限制性内切酶的类型1.1.限制性内切酶的分类目前已鉴定出三种限制性内切核酸酶分别称为Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶，这三种酶具有不同的性质，如下表所示：6性质酶Ⅰ酶Ⅱ酶Ⅲ结构与功能三亚基多功能酶单一功能的酶二亚基双功能的酶限制与修饰酶蛋白同时具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同时具有甲基化作用限制作用的辅助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM寄主特异性位点序列特异性,非对称序列特异性,旋转对称序列特异性,非对称序列切割位点在距寄主特异性位点至少1kb的地方位于寄主特异性位点或其附近在距寄主特异性位点3´端24~26bp处切割方式随机切割特异切割特异切割甲基化作用位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点在DNA克隆中的用途无十分有用有用表2-1限制性内切酶的类型及其主要特征2.限制性内切酶的命名由于发现大量的限制性内切酶，所以需要有一个统一的命名法。具体内容为：属名的第一个字母和种名的头两个字母所组成的3个字母为酶的基本名称，第四个表示菌株的类型，最后的罗马数字表示限制性内切酶发现的顺序。8EcoRⅤ属名种名菌株类型限制酶种类图2-2EcoRⅤ的命名含义EcoRⅤ是从大肠杆菌Escheriacoli中提取的，它的命名如图2-2所示：93.Ⅱ型限制性内切酶的基本特征Ⅱ型限制性内切酶有3个基本特征：①在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割，使DNA双链断裂。②识别序列一般为4、5、6个碱基对。大部分具有双重交替对称序列特点，即识别位点两条互补链的碱基相同。③切割方式有两种：平头末端和粘性末端10切割方式平头末端（bluntendorflushend）经酶切所形成的末端具有互补碱基对完好的末端，称为平头末端。粘性末端（cohesiveend）切割方式大多数Ⅱ型限制性内切酶结合并切割的DNA序列是一种回文序列，经切割一端产生5´-磷酸突出的末端，另一端产生3´-OH突出的末端，即DNA片段双链的两个末端含有几个等长核苷酸碱基互补配对的单链末端，称为粘性末端。12部分常用的限制性内切酶15174.同裂酶（isoschizomers）概念用途有一些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，所以可以用来研究DNA甲基化作用。KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG有一些来源不同的限制性酶识别的是相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。用途如：限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶，共同的靶序列是CCGG。当其靶序列中含有一个5-甲基胞嘧啶（CCGG，*号表示甲基化的碱基），HpaⅡ不能够切割它，而MspⅠ对于这个核苷酸的甲基化作用的反应则是中性的，它不管C残基甲基化与否都能够切割之。*现已研究发现，许多动物DNA中90%以上的甲基，都是在序列CG处以5-甲基胞嘧啶的形式出现。所以，通过比较HpaⅡ和MspⅠ的DNA消化产物就可以检测出甲基化的存在。195.同尾酶（isocaudamer）概念与同裂酶对应的一类限制性酶，它们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。常用的限制酶BamHⅠ、BaclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割DNA后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。举例20BamHI5´...G^GATCC...3´3´...CCTAG^G...5´BglII5´...A^GATCT...3´3´...TCTAG^A...5´Sau3A5´...^GATC...3´3´...CTAG^...5´21用途由于同尾酶切割DNA后产生的是粘性末端，因此，可以通过粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来，这在基因克隆实验中是很有用处的。5.同尾酶（isocaudamer）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称为杂种位点（hybridsite）22四、Ⅱ型限制性内切酶的反应条件23五、影响限制性内切酶活性的因素酶的纯度DNA样品的纯度DNA的甲基化程度酶切反应的温度和时间DNA分子的结构限制性内切核酸酶的反应缓冲液24高质量的限制性核酸内切酶，要求:•不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染;•长时间酶解不出现识别顺序特异性的下降;•酶解的DNA片段连接后能重新被识别和切割等.酶的纯度1.DNA制剂中可能抑制限制性核酸内切酶活性的物质:蛋白质、酚、氯仿、酒精乙二胺四乙酸（EDTA）十二烷基硫酸钠（SDS）高浓度的盐离子等DNA样品的纯度2.提高限制性内切核酸酶对低浓度DNA制剂反应效率的方法①增加核酸内切酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些；②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被响应地稀释；③延长酶催化反应的保温时间。DNA的甲基化1.原核生物的限制-修饰系统的组成成分是：甲基化酶：对自身DNA起修饰作用，从而使限制性内切核酸酶不能识别，保护自身DNA免受降解。限制性内切核酸酶：破坏入侵的外源DNA，防御异源遗传信息进入体内。因此，甲基化作用直接影响限制性内切核酸酶的活性2.从大肠杆菌寄主细胞中分离而来的质粒DNA，通常都混有两种作用于特定核苷酸序列的甲基化酶：dam甲基化酶：催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化。dcm甲基化酶：催化CCAGG或CCTGG中胞嘧啶残基甲基化。293.基于基因工程从以上知识可知：从正常大肠杆菌菌株中分离出来的质粒DNA，只能被限制性内切核酸酶局部消化，甚至完全不被消化。因此，在基因工程中，为了避免产生上述问题，通常使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。酶切反应的温度DNA酶切反应的温度是影响限制性内切核酸酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有很大的变动范围。但，大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度都是37℃。31酶反应温度（℃）ApaⅠBanⅠBstEⅡMaeⅠMaeⅡMaeⅢSmaⅠTaqⅠ3050604550552565表2-2部分限制性内切核酸酶的最适反应温度DNA分子结构DNA分子的不同的构型对限制性内切核酸酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA高出许多倍，最高的可达20倍。33某些限制性内切核酸酶，对于同一DNA分子上不同位置的识别序列，切割效率明显不同。DNA分子结构原因可能是侧翼序列的核苷酸成分的差异造的。一般来说，一种限制性内切核酸酶对其不同识别位点切割速率的差别最多不会超过10倍。限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.缓冲液的主要成分Tris-Cl：使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围内。对绝大数限制酶来说，最佳pH=7.4。MgCl2：保证酶活性的正常发挥。NaCl或KCl：同上。35β-巯基乙醇：防止限制酶的氧化（但也可能有利于潜在污染杂质的稳定性）。牛血清白蛋白（BSA）：对某些限制酶是必需的，它是一种中性蛋白，可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.缓冲液的主要成分362.缓冲液的分类不同酶对缓冲液的离子强度要求不同，据此缓冲液可分为如下三种：低盐缓冲液（L）：10mmol/LNaCl中盐缓冲液（M）：50mmol/LNaCl高盐缓冲液（H）：100mmol/LNaCl限制性核酸内切酶的反应缓冲液37限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.限制性内切核酸酶的多酶联合酶解对盐浓度要求相同的酶，原则上可同时酶切对盐浓度要求相同的酶，可采取下列方法：①低盐酶先切，然后补加NaCl，再用高盐酶切②一种酶先切，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一种缓冲液中用另一种酶切。③使用适合所有限制酶的通用缓冲液，如KGB（谷氨酸钾缓冲液）限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.限制性内切核酸酶的多酶联合酶解39限制性核酸内切酶的反应缓冲液4.星号活性（staractvity）限制性内切核酸酶的识别位点是在特定的消化条件下测定的，当条件改变时，有些酶的识别位点也随之改变，可能切割一些与特异识别序列相类似的序列，这种现象称为星号活性。①概念40限制性核酸内切酶的反应缓冲液4.星号活性（staractvity）①概念（以EcoRⅠ为例）EcoRⅠ在正常条件下识别并切割GAATTC，但在甘油浓度超过5%（V/V）时，也可切割NAATTN（其中N=A、T、C、G），用EcoRⅠ*表示。41限制性核酸内切酶的反应缓冲液4.星号活性（staractvity）②诱发星号活性产生的常见原因高浓度甘油高浓度内切酶低离子强度高pH值含有机溶剂用Mn2+取代Mg2+42第二节DNA连接酶一、DNA连接酶的基本性质1.修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键432.修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键一、DNA连接酶的基本性质44一、DNA连接酶的基本性质3.连接多个平头双链DNA分子：注意：（1）DNA连接酶只能连接相邻核苷酸之间的切刻（nick）；（2）如果是缺少一个或几个核苷酸的裂口（gap），DNA连接酶是无法连接的；46（3）DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分；（4）DNA连接酶催化的连接反应是需要能量的：在大肠杆菌或其他细菌中，利用NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在动物细胞中及噬菌体中，利用ATP（腺苷三磷酸）。注意：47T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶T4噬菌体RNA连接酶二、DNA连接酶的种类T4噬菌体DNA连接酶该酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，是T4噬菌体基因30编码的产物，分子量为68ku，需要ATP作为辅助因子。两个带有互补粘性末端的双链DNA分子一条带有切刻的双链DNA分子两个带有平头末端的双链DNA分子DNA-RNA杂合体分子中切刻该酶可连接49大肠杆菌DNA连接酶该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌基因组中lig基因编码，分子量为75ku，需要NAD+作为辅助因子。具有同源互补粘性末端的不同DNA分子一条带有切刻的双链DNA分子该酶可连接但,该酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连接T4噬菌体DNA连接酶该酶在DNA体外重组中比大肠杆菌DNA连接酶应用广泛(既能连接粘性末端,也能连接平头末端).两种酶各自的优点大肠杆菌DNA连接酶:该酶的连接产物转化细菌后,假阳性背景低(由于它对DNA末端的要求比较严格-----互补粘性末端).52T4噬菌体RNA连接酶T4噬菌体RNA连接酶由T4噬菌体基因63编码,需要ATP作为辅助因子.连接反应:主要用途:对R