天冬氨酸族氨基酸发酵机制---赖氨酸

第八章天冬氨酸族氨基酸发酵机制第八章天冬氨酸族氨基酸发酵机制重点：天冬氨酸族氨基酸生物合成途径及代谢调节机制；天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调节机制；酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径和调节机制；赖氨酸生产菌的育种途径；难点：天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调节机制；氨基酸本身的合成在不同生物体中，有较大的差异，然而许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：㈠谷氨酸族（α-酮戊二酸族）包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸；㈡丙酮酸族包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；㈢天冬氨酸族（草酰乙酸族）包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸；㈣磷酸甘油酸族包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；㈤芳香族包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。第一节生物合成途径（天冬氨酸族）及代谢调控机制一、生物合成途径天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸为原料，合成苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和赖氨酸。葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸天冬氨酸β-半醛赖氨酸高丝氨酸蛋氨酸苏氨酸异亮氨酸EMPCO2固定、氧化氨基化反应天冬氨酸激酶天冬氨酸β-半醛脱氢酶二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶高丝氨酸脱氢酶琥珀酰高丝氨酸合成酶高丝氨酸激酶苏氨酸脱氨酶二、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制在细菌中，虽然天冬氨酸族氨基酸生物合成途径是相同的，但是其代谢调节机制是多种多样的。1.大肠杆菌K12①天冬氨酸激酶（AK）AKⅠ:受苏氨酸、异亮氨酸的多价抑制和阻遏天冬氨酸激酶AKⅡ：受蛋氨酸专一性抑制和阻遏AKⅢ：受赖氨酸专一性抑制和阻遏②天冬氨酸-β-半醛脱氢酶专一性的受赖氨酸不完全的抑制③二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶（赖氨酸分支的第一个酶）DDP合成酶受赖氨酸反馈抑制。二氨基庚二酸（DAP）脱羧酶受赖氨酸阻遏④高丝氨酸脱氢酶（HD）（通向苏氨酸、蛋氨酸分支的第一个酶）HDHDⅠ：受苏氨酸反馈抑制HDⅡ：受蛋氨酸阻遏⑤苏氨酸脱氨酶（异亮氨酸合成途径的酶）受异亮氨酸的反馈抑制和阻遏2.黄色短杆菌其赖氨酸生物合成调节机制比大肠杆菌简单，其天冬氨酸激酶只有一种，该酶具有两个变构部位，可以与终产物结合，当只有一种终产物（赖氨酸或苏氨酸）与酶结合，酶活性不受影响。当两种终产物（赖氨酸和苏氨酸）同时过量时，与酶的两个变构部位结合，该酶活性受到抑制，这种终产物的反馈抑制称为协同反馈抑制。P74图6-33.乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节P75，图6-51）存在代谢优先向苏氨酸和蛋氨酸方向进行。2）与黄色短杆菌区别：AK受赖氨酸+苏氨酸的反馈抑制存在代谢互锁，DDP合成酶的合成受亮氨酸阻遏。DDP还原酶受半胱氨酸和丙氨酸抑制。三、酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径和调节机制所谓同型TCA循环途径进行，但生物合成酶与TCA循环酶完全两样。第二节赖氨酸生产菌的育种途径出发菌株的选择：要求代谢比较简单的细菌（如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌等）1.优先合成的转换：渗漏缺陷型的选育。降低高丝氨酸脱氢酶活性，使代谢流转向优先合成赖氨酸。高丝氨酸脱氢酶渗漏缺陷型。2.切断支路代谢：营养缺陷型的选育。黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌，对天冬氨酸激酶的反馈抑制是赖氨酸+苏氨酸的协同作用，通过诱变使高丝氨酸脱氢酶缺失，切断通向苏氨酸、蛋氨酸的代谢流，控制高丝氨酸（或苏氨酸+蛋氨酸）量，降低苏氨酸浓度，解除协同反馈作用，过量积累赖氨酸。3.抗结构类似物突变株的选育（代谢调节突变）。优点：突变株遗传性地解除了终产物对自身合成途径的酶的调节控制，不受培养基中所要求物质浓度的影响，生产较稳定。通过诱变使天冬氨酸激酶编码的结构基因发生突变，对赖氨酸及结构类似物不敏感，即使有过量苏氨酸存在，该酶也不与赖氨酸或结构类似物结合，但酶活性中心不变。4.解除代谢互锁①选育亮氨酸缺陷型菌株，或者以抗AEC的赖氨酸的生产菌为出发菌株，经诱变得到抗AEC兼抗亮氨酸缺陷型菌株。②选育抗亮氨酸结构类似物的突变株，从遗传上解除亮氨酸对DDP合成酶的阻遏。③选育对苯醌或喹啉衍生物敏感菌株，这是一种寻找亮氨酸渗漏缺陷型菌株的有效方法。5.增加前体物的生物合成和阻塞产物的生成：方法：①选育丙氨酸缺陷型；②选育抗天冬氨酸结构类似物突变株；③选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株；1.通过TCA循环葡萄糖→丙酮酸→草酰乙酸→天冬氨酸赖氨酸2.通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化反应葡萄糖→磷酸烯醇式丙酮酸→草酰乙酸→天冬氨酸丙酮酸赖氨酸6.改变细胞膜的透过性7.选育温度敏感突变株天冬氨酸系分枝代谢途径中，末端产物种类多，调节机制复杂，为高效率生产赖氨酸，可以采取顺次解除各种调节机制的诱变育种，获得多重标记的突变株。8.应用细胞工程和遗传工程育种9.防止高产菌株回复突变选育遗传性稳定的菌株定向赋加生产菌多个遗传标记菌种培养和保藏时，培养基要丰富，尤其有足够的要求营养物培养时添加抗生素，抑制恢复突变株的生长，达到分纯的目的。第三节苏氨酸、蛋氨酸、高丝氨酸和天冬氨酸的育种途径一、苏氨酸的育种途径苏氨酸高产菌株应具备的生化特征DDP合成酶活力极弱或欠缺琥珀酰高丝氨酸合成酶酶活力极弱或欠缺苏氨酸脱氨酶酶活力极弱或欠缺CO2固定能力强天冬氨酸合成能力强天冬氨酸激酶活力强，对苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制不敏感高丝氨酸脱氢酶活力强，不受苏氨酸反馈调节。二、高丝氨酸菌种的选育途径DDP合成酶活力极弱或欠缺琥珀酰高丝氨酸合成酶酶活力极弱或欠缺高丝氨酸激酶欠缺CO2固定能力强天冬氨酸合成能力强天冬氨酸激酶活力强，对苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制不敏感高丝氨酸脱氢酶活力强，不受苏氨酸和蛋氨酸反馈调节。高产高丝氨酸菌株应具备的生化特征三、蛋氨酸育种途径高产蛋氨酸应具备的生化特性DDP合成酶活力极弱或欠缺S-腺苷蛋氨酸酶活力极弱或欠缺高丝氨酸激酶欠缺CO2固定能力强天冬氨酸合成能力强天冬氨酸激酶活力强，对苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制不敏感高丝氨酸脱氢酶活力强，苏氨酸和异亮氨酸的反馈调节不敏感、不受蛋氨酸反馈调节。四、天冬氨酸的育种途径高产天冬氨酸菌株应有的生化特征天冬氨酸激酶丧失丙酮酸氨基化酶丧失CO2固定酶系丙酮酸氧化脱羧要强草酰乙酸氨基化反应强。复习思考题简述黄色短杆菌赖氨酸生物合成的调节机制简述赖氨酸生产菌的选育原则