A06菌种制作技术

第六讲二、三级菌种制作技术《食用菌生产技术》课程组二、三级菌种制作技术一.二、三级菌种培养基的配制二.二、三级菌种培养基的灭菌三.二、三级菌种的接种四.二、三级菌种的培养五.二、三级菌种的质量鉴定原种和栽培种的生产技术原种和栽培种的生产，无论是培养基成分，配制方法和灭菌方法基本上是相同的。1）原种：是由试管斜面培养基培养的母种作种源接种而成，主要用于繁殖栽培种，也可直接用于生产。（母种→原种）2）栽培种：由原种作种源扩大而成，只能用于生产。（原种→栽培种)二、三级菌种制作流程配制培养基灭菌二级菌种培养接种培养接种灭菌配制培养基三级菌种一级菌种二级菌种(二、三级菌种制作过程大同小异)原种、栽培种的制作流程按配方称取原料→拌料→装瓶（袋）→打洞（孔径1cm深至瓶底）→灭菌（1.5kg／cm2，1.5~2h）→冷却→接种（接入黄豆大小一块）→培养（25℃~27℃）→菌丝长满瓶（袋）→培养7d~8d→扩大成栽培种。一.二、三级菌种培养基的配制（一）配制总原则1．选择适宜的营养物质。2．营养物质间配制的比例要恰当。3．选择经济实用、来源广泛的原料。4．适宜的pH值和含水量。培养基（料）配制原则⑴掌握碳氮比例食用菌对碳和氮的需要有一个比例，简称碳氮比（C／Ｎ）。菌丝体生长阶段：C／Ｎ=20∶1；子实体形成阶段：C／Ｎ=30~40∶1；C／Ｎ过高，菌丝体生长过旺，而子实体小、产量低。⑵选好培养材料①首先选不含杀菌物质的木屑杉、松、樟等树种，含酚、酯、精油等杀菌物质，会抑制食用菌生长。要用必须经过处理，如：蒸煮、晒等。②根据食用菌的喜好选木屑如：培养香菇用桦木屑就比椴木屑好；培养金针菇用构，楮等木屑就比用榆、槐等木屑好。⑶注意物理性状培养原料要注意颗粒粗细、质地软硬程度，以及持水性能等物理性状。⑷调节酸碱度各种食用菌需要的pH值不同，配制培养料时，应选用NaOH、石灰、盐酸或过磷酸钙等物质调节pH值。霉菌比食用菌喜欢更低的pH值，生产上有时为了控制这类杂菌的发生，往往将pH值适当调高0.5~1。原料选择的注意事项（几点说明）⑴木屑：树种：除松树、杉树、柏树、樟树、芸香属、按属等树种之外，绝大多数阔叶树和木屑都可以利用。（因其中含有酚、酯、精油等杀菌物质）粗细：不宜过细，以免培养基过湿或通气不良。选择：根据食用菌分解能力选择，分解能力较强的食用菌采用硬质阔叶树木屑，反之采用软质树种木屑。如：金针菇分解能力较弱，以含单宁较少木屑为宜，木屑越陈越好；茯苓菌分解能力较强，可采用颗粒粗的松木屑或松木钉。⑵米糠、麸皮作用作用：补充氮源和维生素。稻草、麦秸、木屑、棉籽壳等纤维素原料，含氮量低。如：木屑含氮量0.03%以下。麸皮：含氮量比米糠多，但维生素不如米糠。米糠：含氮量比麸皮少。用量：一般10%~20%，过多易引起污染。⑶加糖的作用①初期补充碳源，用量1%~5%。②诱导胞外酶的产生。纤维素原料，食用菌利用缓慢。加入少量白糖作为食用菌初期补充碳源，促进菌丝快速生长，同时诱导纤维素酶的产生，更好地利用纤维素。⑷Ca2＋作用①提供食用菌钙离子：原料中加石膏、CaCO3或过磷酸钙、骨粉提供食用菌钙离子；②钙不断中和食用菌产生的有机酸；③钙还能中和单宁；④减少过量K、Mg对菌丝中毒，促进菌丝生长。1、常用培养料的配方和配制方法培养料木屑——米糠培养料：木生菇类，如：木耳、银耳、香菇；草茎或草粪——厩肥培养料：草生菇类，如：蘑菇、草菇；棉籽壳——米糠培养料：多种菇类。（二）培养基常用的配方⑴粪草培养基（适用于蘑菇）稻草或麦秸20kg、粪肥（干）30kg、石膏500g、水适量。方法：稻草切成2cm长＋粪肥→混合发酵＋石膏→调水→装瓶→灭菌1、常用培养料的配方和配制方法⑵稻草麸皮培养基（草菇）干稻草78%、麸皮或米糠20%、蔗糖1%、过磷酸钙1%、水适量方法：稻草切成2cm长→发酵→＋蔗糖＋麸皮＋过磷酸钙⑶木屑米糠培养基（香菇、木耳、猴头、平菇等）木屑78%、麸皮或米糠20%、石膏1%、蔗糖1%、水适量。⑷木屑、麸皮、黄豆粉培养基（银耳）木屑50kg、麸皮15kg、黄豆粉1kg、蔗糖0.75kg、MgSO40.25kg、水70~75kg。⑸棉籽壳培养基（平菇、猴头、金针菇）棉籽壳99.7%、蔗糖0.1%、石膏0.2%、水适量。1、常用培养料的配方和配制方法（三）培养基配制步骤称料拌料调节pH值分装培养料清洁（洗或擦）瓶、袋外壁封口1.不溶性主、辅料混拌均匀2.可溶性辅料溶于水后拌入主辅料3.注意检查含水量（手测法等）比实际要求的pH值调高1左右容器：菌种瓶、菌种袋要求：上紧下松，外紧内松，中间一个洞二.二、三级菌种培养基的灭菌1．灭菌方法及要求高压蒸汽灭菌：压力1.5kg/cm2，温度126-128℃，时间1-2h（谷粒和经过堆制发酵的粪草培养基应达到2-2.5h）。常压蒸汽灭菌：100℃，保持10-12h卧式高压蒸汽灭菌锅2．灭菌效果检验随机取几瓶（袋）置于25-30℃温度下空白培养4-6天，会出现以下情况：全部感杂少数感杂全部没有杂菌3、高压蒸汽灭菌锅的使用方法按照仪器操作说明操作！分析原因？三.二、三级菌种的接种概念：菌种移至新培养基上的过程关键：无菌操作接种接种环境消毒灭菌酒精棉球消毒双手操作器具消毒灭菌开启的管口、瓶口靠近灯焰拔出的棉塞勿触及任何地方动作快、准、稳无菌操作要点接种方法二级种三级种用接种耙取蚕豆大母种放于瓶中料面上用接种匙（镊、铲）取枣大原种放于袋中或瓶中料面上注意：1、严格挑选待接的菌种质量；2、勿接入表面老菌丝及老种块。四.二、三级菌种的培养菌种的培养实际就是对菌丝体的培养培养条件场所清洁空气清新光线暗温度约25℃空气湿度60%~70%培养方法勿堆放过挤及时剔除污染瓶（袋）栽培种的菌袋缺氧时可刺孔增氧控制菌龄（菌丝长满7-10天后使用）五.二、三级菌种的质量鉴定菌丝白（或呈该菌种应有的颜色）均匀、粗壮、有菇香味接种后萌发快无杂色、无黄水、无结皮、无原基、无干缩脱壁等现象菌种出售必须贴有菌种质量合格标签，标明菌种种类、级别、品种、生产单位和接种日期。合格菌种杂菌检查（菌种检查）接种后的原种，一般在3d~5d左右菌丝恢复生长，应每天全面检查杂菌情况，如有污染及时剔除。（正常为白色，若混有其它色泽，应及时处理）；如发现接种块无新菌丝萌发，则认为是死菌，应及时补种。正常：菌丝白色杂菌：黄、红、绿、黑死菌：补种菌种制作过程中，只要做到选择正确的配方和优质原料严格灭菌优良的二、三级菌种严格无菌操作科学培育选择优良菌种↓↓↓↓↓六、制种、保藏中易碰到的问题及处理方法1、母种污染处理⑴细菌污染底部取菌：可根据细菌只发生在培养基表面，而真菌菌丝能穿透到培养基内部的特点，用无菌操作法敲破试管取出培养基，在培养基的底部挑取一小块带有菌丝的培养基，移植到另一试管中培养，可得到纯正的母种。1、母种污染处理⑴细菌污染覆盖培养：将熔化培养基冷却到40℃，倒在已污染细菌的斜面上，使之形成厚约20cm的覆盖层，当食用菌菌丝透过培养基形成新的菌落时，即可挑取转管纯化。1、母种污染处理⑵真菌污染若污染的是青霉、黄霉、木霉等真菌，只要母种菌丝与这些杂菌没有相联或尚有一部分菌丝没有相联，并且这些杂菌的菌丝还没有产生孢子时，可以用无菌方法仔细挑取没有相联的一部分菌丝，移植到另外的试管中继续培育，就能得到纯正的母种。2、原种、栽培种被杂菌污染的原因有哪些？怎样鉴别？根据杂菌开始发生的部位，大致有以下几种污染原因：⑴若杂菌同时在培养基的上、中、下部位发生，主要是由于培养基灭菌不彻底造成的。⑵若杂菌开始发生在接种块上，这很可能是母种或原种已经感染了杂菌；或者是由于接种工具不严格（消毒），把杂菌带入。2、原种、栽培种被杂菌污染的原因有哪些？怎样鉴别？⑶若杂菌先在培养基表面发生，这是由于接种过程中无菌操作不严而引起的。⑷若杂菌是在接种后若干天才发生的，而且是发生在瓶口往下挂的，这说明杂菌是从棉花塞侵入培养基的。引起的原因是培养室湿度过大、棉塞受潮，造成霉菌滋生所致。3、为什么母种不能多次转管移植？母种转管次数多了会削弱菌丝的生活力，降低出菇率，甚至造成菌丝不孕而不能形成子实体。因此母种培育可以一次多培育几支试管，不要反复多次分离转管，以确保菌丝旺盛的生活力。（发生变异）4、优良菌种的标准是什么？各种食用菌菌种，既有特定的质量标准，也有共同的质量标准。这些共同的质量标准主要是纯、壮两条。⑴纯：除银耳菌种，其余各种栽培食用菌均是一种菌丝体的纯培养物，不得混入杂菌或纯培养物以外的其它菌种。例如：香菇7925菌种，只能是7925菌株菌丝体的纯培养。复习思考题1．简述二、三级菌种的制作流程。2．根据实际操作说明如何测定培养基的含水量和pH值。3.分装培养料时，为何要在料中打一个孔？4.简述二、三级培养基的灭菌方法及要求。5.如何检验二、三级菌种培养基的灭菌效果？6.简述一级菌种转接二级菌种，二级菌种转接三级菌种的过程。7.合格的培养室有什么要求？8．试述二、三级菌种的培养方法？9．如何检查二、三级菌种质量？10．请你以一个菌种厂厂长或技术员的身份，谈谈如何搞好菌种生产。