SOD生产汇报

SOD酶的生产•指导老师：张立秋•组员：高亚平李婷洪丽魏颖宋雪君SOD简介•SOD是一种金属酶，含有铜和锌两种离子，需氧生物中，SOD催化使对抗体有关的超氧阴离子变成双氧水，随后被双氧水酶分解，保护机体免受超氧阴离子的影响，是一种新型的抗氧化酶。•超氧化物歧化酶，别名肝蛋白，SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。目录项目一.SOD酵母菌的鉴定与筛选项目二.SOD酵母菌的发酵项目三.SOD的分离提取SOD酵母菌的鉴定与筛选经振荡培养后的诱变菌种运用正交试验设计的方法采用四个因素三个水平选出最适的菌种培养基，进行进一步的发酵培养。在发酵罐中加入最适培养基成分和合适的酵母菌诱变菌种进行发酵扩培，最终获得大量的菌种和发酵产物。SOD酵母菌的发酵（1）固体培养基的制备（2）接种培养（3）液体培养基的制备（4）发酵培养，观察记录1、固体培养基的制备（1）称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。（2）溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。（3）调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。（4）过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去(本实验无需过滤)。•（5）分装•按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内•（6）加塞•培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。•（7）包扎•加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。•（8）标记•用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。•（9）灭菌•将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。3、液体培养基的制备•1、牛肉膏蛋白胨培养基•成分：牛肉膏1.5g、蛋白胨5g、NaCl2.5g（由于没有加糖而导致未能培养出酵母菌）•2、麦芽汁培养基的制备•（1）破碎麦芽（不宜过碎，否则影响过滤）•（2）糖化，将破碎后的麦芽加入500ml的蒸馏水，加入淀粉水解酶，在45℃水浴中保温30min，升温至70℃，保温1h，其间不断搅拌。•（3）检测，用碘液检测糖化程度。糖化液未变色表示糖化完全。•（4）过滤，使用多层纱布过滤糖化液，将滤液煮沸。•（5）加入鸡蛋清高温后过滤，•（6）灭菌，在高压蒸汽灭菌锅中，121℃，0.1兆帕，20min4、发酵培养，观察记录10倍100倍后续又用碘液进行了染色，观察到淀粉粒，查阅资料后得知为酵母肝糖，但未记录sod的提取（1）菌液和收集，将三角瓶中的菌液分装至离心管中，3000rpm离心10min，收集沉淀用pbs缓冲液冲洗1次。菌液分装时发现酵母菌具有产气的特性，导致离心管的盖子不能盖上，故改为用少量多次的方法进行离心。•（2）破碎，每克菌液加入氯仿-异丙醇（1：3）3ml，搅拌2h，3000rpm离心30min，收集上清。•（3）纯化，将清液缓慢加入硫酸铵至75%饱和度（8.7g/100ml）过程充分搅拌5℃至分层，离心（3000rpm）取沉淀。sod的检测利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。试液空白酶提取液1C液/mL2.352.35磷酸缓冲液/mL21.5样液/mL00.5D液/mL0.150.15于10mL比色管中立即混合均匀然后倾入比色皿SOD活性测定加样表式中:U/mL一SOD酶活力单位;△A325一邻苯三酚自氧化速率;△A`325一样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率;V一所加酶液或样液体积，单位为毫升(mL);D一酶液或样液的稀释倍数;V1一样液总体积，单位为毫升（mL）；m一样液质量，单位为克（g）4.5一反应液总体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留三位有效数字。检测数据1组2组3组4组平均值空白0.1310.1160.1330.940.119样液0.1010.1090.1050.1100.106SOD活力=1*0.21*4.5*500.1190.01300=5.175•电泳则采取垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可采用SOD活性正染色（呈现棕色区带）也可采取SOD活性负染色（呈现无色透明区带）。根据凝胶上电泳分离的SOD区带的着色深浅与面积大小，对样品进行半定量分析，也可制作校正曲线计算样品中的SOD含量。染色定位法常用于鉴定SOD，很少为了定量，主要原因是它不及化学法简便，但鉴定SOD却较化学法为优。用电泳法可鉴定SOD是否掺有杂质蛋白，有无同工酶，且可半定量地确定SOD的活性大小。葡聚糖凝胶电泳•染色液：考马斯亮蓝1g200ml甲醇50ml冰醋酸加蒸馏水至500ml。（染色液的配制中含有大量有毒物质故应戴上手套）。•脱色液：80ml甲醇20ml冰醋酸加蒸馏水至200ml（由于冰醋酸挥发性强故应密封）谢谢观看