临床微生物实验室细菌鉴定指南

临床微生物实验室细菌鉴定指南(续)温州医学院附属第一医院实验诊断中心潘钦石一．细菌的鉴定步骤1．鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有已知菌种进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程。2．对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板上生长良好，有单个菌落可以进行生化试验。（我们这里一般都是预先纯化培养）3．对待鉴定的菌种进行革兰染色，观察形态（G+c，G–b，G–c，G+b），做触酶，氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。要注意对待鉴定的菌种选择一个合适的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。4．按鉴定质控单的要求填写好病人姓名，年龄，性别；标本类型，标本编号，送检日期等。另外最重要的是要填写好该菌种的菌落形态以及有无溶血。5．复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。⑴．革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最基本最重要的染色方法。首先要将待鉴定的细菌涂片，固定（目的：杀死细菌，改变细菌对染料的通透性）。第一步：以结晶紫初染（染色液Ⅰ）第二步：以卢戈氏碘液媒染（染色液Ⅱ）第三步：用95%乙醇脱色（染色液Ⅲ）第四步：最后用稀释复红复染（染色液Ⅳ）⑵．触酶实验(H2O2实验)：a.原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开，滴加3%过氧化氢数滴，观察结果（立即有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性）。要注意不能在血平板上进行实验，这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假阴性结果；还有不能在接种针或环上进行实验。c.阳性对照用金黄色葡萄球菌，阴性对照用链球菌；试剂要避光置4℃冰箱保存。d.应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实验阳性，链球菌属阴性。临床常见细菌鉴定实验中我们一般用于区别葡萄球菌属（+），微球菌属（+），链球菌属（－）。⑶．氧化酶实验（Kovac实验）：a.原理：氧化酶又称细胞色素酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。酶并不直接与试剂（1%盐酸四甲基对苯二胺）起反应，而是首先使细胞色素c氧化，然后氧化型细胞色素c使对苯二胺氧化，出现深兰色反应。b.方法（滤纸法，菌落法，试剂纸片法）：一般我们采用滤纸法，取白色洁净滤纸条，沾取菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即呈粉红色，继而出现深兰色。结果读取在10秒钟时为最佳，60秒内读取可靠。本实验避免接触含铁物质（假阳性），也不能在含糖培养基上生长的菌落进行实验（假阴性）。c.阳性对照用铜绿假单胞菌，阴性对照用大肠埃希菌。d.应用：奈瑟氏属的菌种均阳性，也用于区别假单胞菌属和肠杆菌，前者阳性，后者阴性。二．葡萄球菌属的鉴定葡萄球菌属主要的种有金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌。1．形态与染色：葡萄球菌直径0.5～1.5μm，菌体圆形，呈单个，成双以及不规簇状排列。染色呈紫色，为革兰阳性球菌。2．与链球菌的区别：触酶实验为阳性，而链球菌阴性；菌体形态链球菌小于葡萄球菌，呈成双和链状排列的卵圆形的革兰阳性球菌。3．与微球菌的区别：触酶实验同为阳性，但微球菌的菌体呈四联状，要大于葡萄球菌，微球菌葡萄糖氧化发酵实验（操作方法同甘露醇OF试验）为氧化型；而葡萄球菌为发酵型。另外呋喃唑酮（即痢特灵50μg/片）敏感实验微球菌为耐药，而金黄色葡萄球菌为敏感。4．葡萄球菌属的种间鉴定：⑴．菌落色素与溶血毒素：金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄色，柠檬色或者淡黄色，而其他葡萄球菌则在血平板上菌落大多数为白色，也有部分为柠檬色或深黄色。⑵．溶血毒素：金黄色葡萄球菌有α﹑β﹑γ﹑δ溶血毒素，各毒素的区别是对动物红细胞的溶血范围﹑抗原性及溶血时的温度等。其中以α溶血毒素为主。而其他葡萄球菌大多数不产生溶血毒素，只有表葡有极少能产生溶血毒素。⑶．血浆凝固酶实验：用与区别金黄色葡萄球菌（阳性），表皮葡萄球菌（阴性），腐生葡萄球菌（阴性）。血浆凝固酶是金葡菌所产生的，有结合凝固酶和游离凝固酶两种。血浆凝固酶检测有两种方法，为玻片法和试管法，我们一般采用玻片法。a.操作方法：挑取少许金黄色葡萄球菌菌落在玻片上与血浆乳化，结合凝固酶能作用于血浆中的纤维蛋白原，从而在金黄色葡萄球菌表面发生凝集，所以我们肉眼能看见凝集颗粒。玻片法主要由结合凝固酶作用产生；游离凝固酶是金黄色葡萄球菌产生的胞外酶，能与血浆中的血浆凝固反应因子（类似凝血酶的一种物质）作用，形成复合物再使纤维蛋白原转化成纤维蛋白而发生凝集。试管法主要由游离凝固酶作用产生。b.注意事项：菌落不能太多，否则会影响结果观察；凝固酶阳性要做自凝阴性对照（用生理盐水代替血浆），只有在阴性对照也不凝集才能认为是真正的阳性，有一部分葡萄球菌有自凝现象。⑷．新生霉素敏感实验：金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌对新生霉素纸片（5μg/片）敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌则对之耐药。抑菌环直径16mm即为新生霉素敏感。⑸．甘露醇氧化发酵实验：a.操作方法：取两支甘露醇微量生化管，在微量管内接种待检细菌，然后一支加两滴石腊密封，另外一支则不加，放37℃孵箱内18～24h后观察结果。b.结果观察：微量生化管变黄色为阳性，也就是能利用甘露醇。若两管都变黄色则说明是发酵型；其中加石蜡管不变色，没加石蜡管变黄色则为氧化型；如果两管都不变色则说明该细菌是不利用甘露醇（产碱型）。c.应用：金黄色葡萄球菌在需氧和厌氧的条件下都能利用甘露醇（即两管都变黄色）；表皮葡萄球菌需氧部分产酸，厌氧条件下不利用甘露醇（即没加石蜡管有部分会变黄色，加石蜡管不变黄色）；腐生葡萄球菌与表皮葡萄球菌类似。三．微球菌属的种间鉴定微球菌属主要的种有易变微球菌，藤黄微球菌，玫瑰微球菌。鉴定生化见下表微球菌属的种间鉴定易变微球菌藤黄微球菌玫瑰微球菌色素产生黄色黄色粉红色需氧葡萄糖产酸＋＋－硝酸盐还原＋－－脲素酶dd＋氧化酶－＋－/＋（弱）新生霉素敏感S/RSRd：不定S：敏感R：耐药四．链球菌属1．形态和染色：链球菌的直径为0.5～1.0μm，呈成双和链状排列的卵圆形革兰阳性球菌，菌体小于葡萄球菌，无鞭毛，没有芽胞，但有些菌株会形成荚膜。肺炎链球菌呈矛头状，宽端相对，尖端向外。2．根据链球菌在血平板上溶血现象的不同分为三种：⑴甲型（α-）溶血，即菌落周围出现较窄的草绿色溶血环；⑵乙型（β-）溶血，即菌落周围出现较宽的透明溶血环；⑶丙型（γ-）溶血，即菌落周围无溶血环。3．根据抗原结构（C多糖抗原）的不同可分为A﹑B﹑C﹑D﹑E﹑F﹑G﹑H﹑K﹑L﹑M﹑N﹑O﹑P﹑Q﹑R﹑S﹑T等18个群，对人类有致病者90%属于A群，偶见其他群链球菌致病。4．链球菌属的种间鉴定⑴．乙型溶血链球菌的鉴定：a．对杆菌肽（0.04U/片）（抑菌圈直径≥10mm）敏感：A群链球菌（主要为化脓性链球菌）。b．对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，但马尿酸钠水解实验﹑CAMP实验阳性：B群链球菌（主要为无乳链球菌）。c．对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，马尿酸钠水解实验阴性，CAMP实验阴性：主要为马链球菌﹑类马链球菌﹑兽疫链球菌；对三者的区别实验要加做海藻糖和山梨醇实验。d．CAMP实验：将能产生β-溶血的金黄色葡萄球菌在血平板上划一横线接种，再将待鉴定菌于金黄色葡萄球菌3mm处垂直种一短线，若在有CO2条件下培养5～6小时，或无CO2条件下培养18～24小时，在两细菌连接处出现一个半月型的加强溶血区即为CAMP实验阳性。⑵．甲型溶血链球菌的鉴定：a．草绿色链球菌：对杆菌肽敏感，对奥普托欣（Optochin）不敏感，胆汁溶菌实验阴性，胆汁七叶苷实验阴性，在高盐中不生长。主要有变异链球菌，轻型链球菌，血链球菌，唾液链球菌等。b．肺炎链球菌：菌体呈矛头状，成双排列，钝端相对，尖端相背，较葡萄球菌，其他链球菌略大；在血平板上菌落细小﹑圆形﹑表面光滑﹑灰白色﹑半透明，开始时菌落呈扁平状，以后中心塌陷，呈脐窝状。与草绿色链球菌的主要区别是胆汁溶菌实验阳性，对奥普托欣（Optochin）敏感。奥普托欣（Optochin）含量为5μg/片，抑菌环18mm为敏感，15mm为不敏感，15～18mm应重复实验。⑶．肠球菌（D群链球菌）的鉴定：溶血不定，主要是α-﹑γ-溶血；对杆菌肽不敏感，但其特异性实验是胆汁七叶苷实验阳性；若能在6.5%NaCl的心浸液肉汤中生长即为D群肠球菌，不能生长为D群非肠球菌。⑷．链球菌属鉴定的系统生化结果判断a．1%美兰牛乳b．胆汁七叶苷实验：变黑为阳性。c．PH9.6肉汤实验：变浑浊为能在碱性环境中生长（阳性）。d．6.5%NaCl心浸液肉汤：由紫变黄为能在高盐环境中生长（阳性）。e．精氨酸双水解酶实验：变红色（对照不变色，仍为黄色）为阳性。五．奈瑟氏菌属和布兰汉菌属奈瑟氏菌属主要有脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌；布兰汉氏菌属只有卡他布兰汉氏菌。两者系需氧革兰阴性球菌。⑴奈瑟氏菌的生物学特性：革兰阴性球菌，需氧，卵圆形或肾形，无动力，氧化酶及触酶均阳性。培养时对营养要求高，能在巧克力平板或有丰富营养的血平板上，在5～10%CO2环境中生长。⑵．鉴定过程：a．DNA酶实验阳性为布兰汉氏菌，阴性则为奈瑟氏菌。b．能在普通血平板上生长的为其他奈瑟氏菌，在巧克力平板上生长的主要为脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌。c．能使麦芽糖氧化分解产酸的是脑膜炎奈瑟氏菌，不利用麦芽糖的是淋病奈瑟氏菌。⑶．几种主要细菌对葡萄糖﹑麦芽糖﹑蔗糖的氧化分解产酸结果如下：氧化分解产酸菌种葡萄糖麦芽糖蔗糖淋病奈瑟氏菌＋－－脑膜炎奈瑟氏菌＋＋－粘液奈瑟氏菌＋＋＋卡他布兰汉菌－－－⑷DNA酶实验：a．方法：将待鉴定细菌点种于含0.2%DNA的DNA琼脂平板上，培养后用1mmol/LHCl覆盖平板，菌落周围出现透明环者为阳性。b．原理：某些细菌能产生DNA酶，可使DNA长链水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链；长链DNA可被酸沉淀，而水解后形成后的寡核苷酸链则可溶于酸，故在DNA琼脂平板加盐酸，可在菌落周围形成透明的溶血环。（肠杆菌科中只有沙雷氏菌和变形杆菌可产生DNA酶，阳性球菌中只有金葡菌能产生DNA酶。）六．肠杆菌科肠杆菌科是一大群生物学性状相似的革兰阴性杆菌，其中对人致病性较强的鼠疫耶尔森菌（现已基本没有流行）和伤寒沙门菌；4类常引起腹泻和肠道感染的细菌（埃希氏菌﹑志贺氏菌﹑沙门氏菌﹑耶尔森氏菌）和8种常导致院内感染的细菌（枸橼酸杆菌属﹑克雷伯菌属﹑肠杆菌属﹑多源菌属﹑沙雷菌属﹑变形杆菌属﹑普罗威登菌属和摩根菌属）。另外还有很多细菌是肠道的正常菌群，但在一定条件下也可致病（条件致病菌）。实验过程中对于革兰阴性杆菌首先要做氧化酶实验，阴性为肠杆菌科细菌；阳性的为非发酵菌（我们实验室还没有简单的系统鉴定方法，一般要仪器上卡检测）或弧菌科细菌。1．肠杆菌科的系统生化⑴．KIA试验（克氏双糖铁）组成：乳糖／葡萄糖=10／1（斜面／高层，其长度最好是都是2CM）结果判断：斜面或高层变黄色：阳性；不变色（红色）：阴性高层中出现裂隙：产气阳性高层中出现黑色（FeS）：产H2S阳性⑵．苯丙氨酸脱羧酶试验细菌产生的苯丙氨酸脱羧酶使苯丙氨酸氧化脱羧后生成苯丙酮酸，再与10%的FeCl3试剂产成深绿色反应。（变形杆菌属﹑普罗威登菌属和摩根菌属为阳性，其他为阴性）⑶．枸橼酸盐试验（碳源利用实验）在枸橼酸盐培养基中细菌能利用的碳源只有枸橼酸盐，分解后生成碳酸钠，使培养基变碱性，pH指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿色变为深兰色，即为枸橼酸盐试验阳性。（埃希氏菌属，志贺氏菌属，爱德华菌属为阴性，其他为阳性）注意：接种时不能被糖，蛋白胨污染，要单独接种）⑷．甲基红（MR）试验细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸等，使培养基的pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂由桔黄色变桔红色为弱阳性；变红色为阳性。培养基成分：葡萄糖蛋白胨水试剂：甲基红0.1g，酒精300ml，水200ml主要用于大肠埃希菌（＋）和产气肠杆菌（－）的鉴别；常与V-P实验联合使用，一般情况下两者结果正好相反，但也有例外如奇变两