利用重组酵母菌生产人胰岛素

利用重组酵母菌生产人胰岛素摘要：利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建，根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子，采用基因半合成技术合成人胰岛素基因。将合成的胰岛素基因克隆到pPIC9质粒，构建了毕赤(Pichia)酵母重组表达载体pPINS319，用BglII线性化后用电转化法导入毕赤酵母GSll5菌株，经过营养筛选和PCR复筛，得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株。后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产，通过补料-分批发酵获得发酵液，分离纯化后获得人胰岛素。纯化后的重组人胰岛素产品经SDS-PAGE检测，氨基酸组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。关键词：重组酵母；人胰岛素；发酵；纯化；鉴定UsingrecombinantyeasttoproducehumaninsulinHuSheng1142043040Abstract：Theproceedingsofproducehumaninsulinbyrecombinantyeastshowasfollow:getpurposegene→constructtherecombinantplasmid→constructthegeneticengineeringbacteria→fermentationofengineeringbacterium→separationandpurificationoftheproduct→identificationoftheproduct.Thefrontthreeprocessesisbuildingengineeringbacteriaofhumaninsulinyeasts.Insulingenewassynthesizedaccordingtotheaminoacidsequenceofhumaninsulinandyeastpreferentialcodons.TheinsulingenewasclonedintopPIC9vectorandexpressionvectorpPINS319wasconstructed.TheexpressionvectorwasdigestedwithBgllIandthenusedtotransformPichiaPastorisGSll5byelectroporation.TheexpressionanalysisshowedthattheinsulingenewsabletoexpressedefficientlyinPichiaPastoris.Theposteriorthreeprocessesislarge-scaleproductionbyfermentation.Throughfed-batchfermentationgettingfermentationliquor,separationandpurificationthefermentationliquorgettinghumaninsulin.Thefinalproductspurifiedbysupedrex75showedonebandbySDS-PAGEanalysisandwereidenticalwiththenativehumaninsulinbyallcritetiaemployed.(SDS-PAGEanalysis,aminacidcompositionanalysisandbioidentityassay)Keywords：recombinantyeast;humaninsulin;fermentation;purification;identification胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。最初的重组表达是通过大肠杆菌分别表达出胰岛素的A链和B链。现在，胰岛素作为重组蛋白产品，主要有两条途径获得。一条途径是在大肠杆菌中表达胰岛素前体的包涵体，通过溶解和复性等过程获得胰岛素。另外一条途径是通过酵母表达系统，分泌表达可溶性的胰岛素前体进入培养液。由于对酿酒酵母大规模培养有丰富的经验，使其成为了第一个分泌表达胰岛素前体的酵母系统。虽然酿酒酵母仍然是主要的胰岛素产品表达系统，近些年几个备选的表达系统也提供了可能性。其中，毕赤酵母是一种非常有用并且优势明显的表达宿主。尤其是它强有力的醇氧化酶启动子，受甲醇严格诱导调控，通过简单培养可以达到较高的细胞密度，能够稳定且高水平表达外源蛋白。利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建；后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产。本报告将从两个方面来介绍，如何利用重组酵母菌生成人胰岛素。产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建1材料和方法1.1材料1.1.1菌种和质粒E.coliDH5α、PichiapastorisGSll5、pPIC9购自Invitrogen公司；pMD18-T购自TaKaRa公司。1.1.2试剂和酶限制性内切酶、T4DNA连接酶、5′磷酸化酶、Klenow大片段及去磷酸化酶均购自TaKaRa公司；pfuDNA聚合酶、Taq-plus、胰蛋白酶和羧肽酶B购自上海生工生物工程有限公司；PCR回收试剂盒购自TaKaRa公司；四个片段基因均委托上海博亚生物技术公司合成；其它常规生化试剂均购自国内有关公司。1.2方法1.2.1胰岛素基因的克隆参考159种在酵母中表达的蛋白，每种氨基酸均选择酵母中高频使用的密码子，将人胰岛素基因设计为两两末端互补的四个片段分别进行化学合成，经变性、退火以及KlenowI补平，获得完整的胰岛素基因片段。用于酶促合成胰岛素基因的四个片段长度都为59bp：Frg1:5′-AGCGGATCCATGTTCGTTAATCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAGGCTTTGTA-3′Frg2:5′-CTAGTCTTTGGAGTGTAGAAGAAACCTCTTTCACCACAAACCAAGTACAAAGCCTCAAC-3′Frg3:5′-ACTCCAAAGACTAGAAGAGGTTCTAGAAAGGGTATCGTTGAAC获得目的基因构建重组质粒产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建构建基因工程菌胰岛素大规模发酵生产工程菌发酵产物分离产物检验AATGTTGTACTTCTAT-3′Frg4:5′-GCCGTCGACTTAATTACAGTAATTTTCCAATTGGTACAAAGAACATATAGAAGTACAAC-3′上述四个片段中：Frgl的5′和Frg2的3′含有15个互补碱基；Frg2的5′和Frg3的3′含有14个互补碱基；Frg3的5′和Frg4的3′含有14个互补碱基。将四个片段等量混合,经过高温变性和迅速退火后，四个片段通过互补碱基进行配对，由于Frg2和Frg3的5′，经过了磷酸化处理，在Klenow聚合酶的作用下，缺口处从3′向5′进行延伸合成完整的人胰岛素基因。用聚丙烯酰胺凝胶回收195～196bp的片段，克隆到pMDl8-T载体，转化E.coliDH5α，进行方向鉴定后，委托上海生工生物工程有限公司测序。根据测序结果，判断酶促合成的胰岛素基因是否已经正确克隆到pMDl8-T的EcoRV多克隆位点，基因碱基序列是否与原设计序列完全吻合。所克隆的胰岛素基因命名为ins319，此载体命名为pMINS319。1.2.2毕赤酵母表达载体的构建和转化1.2.2.1表达载体pPINS319的构建：根据pPIC质粒多克隆位点的序列特点，为确保表达产物经信号肽酶切割后产生精确的胰岛素蛋白N末端，并能直接进行定向克隆，重新设计上游和下游引物，在上游引物5′端添加pPIC9质粒XhoI位点处的12个碱基(包括XhoI位点和编码信号肽酶识别位点两个氨基酸的序列，5′-CTCGAGAAAAGATTCGTTAATCAACACTT-3′，下游引物添加EcoRI位点(5′-GAATTCCCGTCGACTTAATTACA-3′。以此引物和pMINS319质粒为模板进行PCR扩增，SDS2PAGE电泳回收扩增的胰岛素基因片段，将该片段和质粒pPIC9分别用XhoI和EcoRI酶切，电泳回收大片段；将酶切的基因片段与pPIC9大片段混合，用T4连接酶连接，构建成毕赤酵母表达载体pPIN319。1.2.2.2表达载体pPINS319的酶切鉴定：为确证胰岛素基因克隆到了pPIC9上，采用XhoI和EcoRI双酶切鉴定pPINS319，并利用琼脂糖凝胶电泳(2%琼脂糖凝胶)检测，若泳道出现一条9.2kb和200bp左右的电泳条带，表明重组质粒pPINS319含有所预期的基因片段。1.2.2.3毕赤酵母电击转化及转化子检测：重组质粒pPIN319用BglII酶切使之线性化，然后用电击法转化毕赤酵母菌株GSll5感受态细胞。在MD培养基上培养两天后，长出大约200个转化子。挑取20个转化子接种在MM培养基上，有11个转化子在以甲醇做为唯一碳源的MM培养基上能够缓慢生长(Huts型)。为确证胰岛素基因已整合到毕赤酵母菌株GSll5染色体上，分别提取11个经过初步筛选的阳性转化子的基因组DNA，并以之为模板进行PCR鉴定。阳性转化子的PCR鉴定结果(2%琼脂糖凝胶)。胰岛素大规模发酵生产1菌体培养1.1摇瓶培养方法温度30℃，摇床转速230r/min，摇瓶装液量30mL/300mL三角瓶。1.2分批补料发酵方法1.2.1种子液制备从新鲜YPD平板上挑取单菌落，接入含BMGY培养基50mL/300mL的摇瓶，30℃、230r/min下培养20h，作为一级种子。再以10％的接种量接入BMGY培养基50mL（10瓶），同样条件下培养18h，至OD600为20左右，作为发酵罐种子液。1.2.2分批补料发酵培养在12.8L全自动发酵罐中进行，发酵罐中装入改良BSM培养基6L，按8％接种，培养过程中通气量不小于10L/min，通过改变搅拌转速保持溶氧水平不低于30％，用氨水调节pH至6.6。菌种生长初期DO较高，随着茵体的生长，耗氧量增加，DO不断下降。待DO降到30以下时，提高转速，当搅拌速率达到800r/min，解除溶氧搅拌关联。当DO陡然上升（表明甘油已经耗尽，耗时约16h），开始补加50％甘油(含12mL/LPTMl)，并控制流加速度维持DO在30％-40％，当发酵液的OD600至300左右时，开始加入甲醇（含12mL/LPTMl）诱导，甲醇补加速率由低到高，甘油补加速率逐渐降低最后停止，该过度阶段约维持4-6h。根据溶氧的变化及尾气分析仪在线检测到的C02变化情况及时调整甲醇和氮源补加速率，适时放罐。2人胰岛素前体的纯化与后加工超滤系统简介：由氮气钢瓶、超滤杯、超滤膜组成。本系统工作压力0.2MP左右（不要超过0.3MP）；膜使用前要进行预处理，使用后要清洗。膜的预处理：对于新的膜直接用去离子水浸泡半小时后即可使用。使用过的膜应用0.1%的氢氧化钠溶液浸泡，再用去离子水浸泡半小时，冲洗至pH值呈中性，即可使用。膜的清洗与保存：膜使用后立即用去离子水反复冲洗几遍，再用0.1%的氢氧化钠溶液冲洗两遍，保存于0.1%的氢氧化钠溶液中，并需每周更换一次此0.1%氢氧化钠浸泡溶液。2.1人胰岛素前体的纯化1）发酵液400mL预处理：6000r/min×5min，取上清液；2）超滤（100K的膜）处理发酵液上清，收集滤出液；3）超滤（30K的膜）处理滤出液，收集滤出液；4）超滤（6K的膜）处理滤出液，待滤出液在350mL左右，停止超滤，往杯内加入150mL蒸馏水，继续超滤，至滤出液达150mL左右，停止超滤，收集超滤杯中溶液；5）丙酮沉淀人胰岛素前体：在上一步收集的溶液中慢慢加入4倍体积-20℃预冷的丙酮，边加边搅拌，4℃沉淀2小时；6）轻轻倾去丙酮溶液，收集沉淀，低温下真空干燥，收集人胰岛素前体粗品；停止超滤，收集超