第五章--生物质谱仪器与技术讲解

第五章生物质谱技术与仪器谢圣高2重点提示1.质谱仪的工作原理是什么？2.质谱仪有哪些主要部分？其主要作用是什么？对质谱仪的性能有何影响？3.质谱仪中的质量分析器主要有几种？各自有什么特点？4.质谱仪中常见的离子源有哪些？它们的主要特点是什么？5.质谱联用技术有哪些？各有什么主要特点？6.质谱仪在生物医学领域中有哪些主要应用？7.同位素稀释-质谱法（ID-MS）的原理和主要特点是什么？8.什么叫MALDI-TOF-MS？它有什么主要应用？目录第一节质谱仪第二节质谱联用技术第三节质谱仪在生物医学领域中的应用本章小结第一节质谱仪质谱仪离子源中的样品，在极高的真空状态下，在电子、电场、光、热或激发态原子等能量源作用下，将物质气化、电离成正离子束，经电压加速和聚焦导入质量分析器中，一般利用离子在电场、磁场中运动的性质，按离子质荷比(m/z)的大小顺序进行收集和记录，得到质谱图。也可以按质荷比-相对强度或离子强度列表，得到质谱表。一、质谱仪的工作原理质谱图纵坐标为离子相对强度：以离子强度最强峰为100，其他的峰则以此为标准，确定其相对强度，又称相对丰度；或为离子强度（离子流强度）横坐标为质荷比。质谱图一、质谱仪的工作原理二、质谱仪的组成7个部分：•真空系统•进样系统•离子源•加速器•质量分析器•检测器•计算机系统加速器质量分析器进样系统计算机系统检测器离子源真空系统质谱仪的基本结构框图+++检测器质量分析器离子源计算机系统进样系统eg样品板LC或GCEI源FAB源MALDI源ESI源，等quadrupoleIontraptime-of-flight,etc电子倍增器，闪烁计数器，等++++++++++++++++++++++++++加速器真空系统闪烁计数器：由闪烁体(也称荧光体)和光电倍增管构成二、质谱仪的组成（一）真空系统覆盖区：凡是有样品分子和离子存在的区域。作用：降低背景；减少离子间或离子与分子间碰撞所产生的干扰，如散射、离子飞行偏离、质谱图变宽等；延长灯丝寿命（残余空气中的氧能烧坏离子源的灯丝）。真空度：1.0×10-4～1.0×10-7Pa。特别是质量分析器要求高真空度。二、质谱仪的组成（二）进样系统根据是否需要接口装置，分为两种方式：吸附在固体上或溶解在液体中的挥发性样品：通过顶空分析器富集样品上方的气体，利用吸附柱捕集，再程序升温使之解吸附，经毛细管导入气态、高沸点液态样品：通过可调喷口装置导入1.直接进样固体样品：常用固体直接进样杆（盘）导入2.通过接口进样：将气相色谱（GC）载气去除或将液相色谱(LC)的溶剂去除后导入质谱。GC–MS,LC-MS二、质谱仪的组成2020/2/26（三）离子源（ionsource）•使气化样品中的原子、分子电离或分子碎片成为正离子，又称为电离源。离子源与质谱仪的性能直接相关“·”表示未配对的单电子，“+”表示正离子。分子失去一个电子而电离所产生的自由基离子，称为分子离子（）。分子离子进一步发生键的简单断裂，而产生质量数较低的碎片，即失去游离基（自由基）后的正离子，称为碎片离子M常见的分子破碎过程示意图二、质谱仪的组成常见离子源电离方式电子电离（EI）化学电离（CI）场电离（FI）场解吸（FD）快原子轰击（FAB）电喷雾电离（ESI）大气压化学电离（APCI）基质辅助激光解吸电离（MALDI）电喷雾解吸电离(DESI)二、质谱仪的组成1.电子电离源（EI）原理：用电加热铼或钨丝至2000℃，产生10～70eV的高速电子束，与进入电离室的试样分子发生碰撞，若电子的能量大于试样分子的电离电位，将导致试样分子的电离。试样分子M失去一个电子形成的M+称为分子离子。所需能量为15～20eV。当具有更高能量（如70eV）的电子轰击有机化合物分子时，就会使分子中的化学键断裂，生成各种低质量数的碎片离子和中性自由基。加速聚焦加速2.化学电离源（CI）样品分子在承受电子轰击前，被一种反应气体(通常是甲烷)稀释，稀释比例约为104:1，因此样品分子与电子的碰撞几率极小，所生成的样品分子离子主要经过离子-分子反应组成。应用强电场诱导样品电离：(电压：7～10kV，d1mm)过程：样品蒸汽邻近或接触带高的正电位的阳极尖端时,由于高曲率半径的尖端处产生很强的电位梯度,使样品分子电离.3.场致电离源（FI）过程：样品溶液涂于发射器表面—强电场—分子电离—奔向阴极—引入磁场特点：特别适于非挥发性且分子量高达10,0000的分子。样品只产生分子离子峰和准分子离子峰，谱图最为简单。4.场解析电离源（FD）5.快原子轰击电离源（FAB）过程：稀有气体（如氙或氩电离）通过电场加速获得高动能——快原子——快速运动的原子撞击涂有样品的金属板——金属板上的样品分子电离——二次离子——电场作用下，离子被加速后——通过狭缝进入质量分析器。电喷雾电离（ESI）（三）离子源大气压电离（API）ESI与APCI统称为大气压电离（atmosphericpressureionization,API），主要用于液质（LC-MS）联用。1Torr=1mmHg=0.133KPa,1atm=760mmHg=760×0.133Kpa＝101Kpa（三）离子源8.基质辅助激光解吸电离（MALDI）MALDI：matrix-assistedlaserdesportionionization将样品溶液和基质混匀，干燥成为晶体或半晶体，在激光（如337nm紫外氮激光）照射下，基质吸收能量后瞬间由固态转化为气态，将质子转移给样品分子使其离子化.（三）离子源基质辅助激光解吸电离（MALDI）（三）离子源电喷雾解吸电离(desorptionelectrosprayionization，DESI)前期同ESI，但不含样品，被分析的样品放置在聚四氟乙烯的固相表面上，ESI生成的呈喷雾状的带电小液滴被喷射到样品表面，液滴中含有的溶剂(如甲醇、水等)立即对待测物进行萃取、溶解，之后液滴从表面反弹后形成更加细小的液滴，导致溶剂快速蒸发，由液相转变为气相（相转移），而电荷残留在待测物分子中，从而完成了待测物分子的气相离子化过程。（三）离子源电喷雾解吸电离(DESI)（三）离子源•无需进行样品预处理，在常压下在相对开放的空间内可以对固体表面上的痕量物质进行快速质谱分析，是原位、实时、在线、非破坏、高通量、低耗损、无污染的质谱学方法，除了能用于生物体的原位活体分析，还在食品药品、环境安全、刑侦、直接质谱成像等诸多领域具有广阔的发展前景。2020/2/262020/2/262020/2/26（四）加速器在离子源中产生的各种不同动能的正离子，在加速器的高频电场中加速，增加能量后，因其轨迹半径不同而初步分开。加速器包括回旋加速器、直线加速器等二、质谱仪的组成（五）质量分析器质量分析器可以将离子源产生的离子，在电磁场的作用下，按照质荷比的大小分离聚焦。分析器类型来划分质谱仪的分类依据。常见的质量分析器：1.单聚焦分析器2.双聚焦分析器3.四极杆分析器4.离子阱分析器5.飞行时间分析器6.傅立叶变换离子回旋共振分析器二、质谱仪的组成1．单聚焦分析器在一扇形磁场作用下，离子沿着不同的曲率半径轨道运行而被分离，进行速度（或能量）聚焦。特点：结构简单，操作方便只作速度（或能量）聚焦分辨能力很低。一般将单聚焦分析器称为磁分析器。（五）质量分析器2．双聚焦分析器离子先后通过一个静电分析器和一个磁分析器，前者使质量相同而速度不同（即能量不同）的离子作方向聚焦，符合一定偏转大小即速度相同的离子才能通过狭缝进入后者，再进行m/z方向的聚焦（五）质量分析器双聚焦分析器特点：同时作速度（或能量）和方向的聚焦，分辨能力较高，能准确测定相对分子质量。但扫描速度慢，操作、调整比较困难，灵敏度较低，造价昂贵。有时将单、双聚焦分析器统称为磁分析器（五）质量分析器3．四极杆分析器（五）质量分析器四极杆分析器由四根平行的棒状电极对角相连组成。当恒速的离子流通过电极时，在直流电压U1/射频电压U2比值不变时改变U2值，在某一特定的U2时，只允许某一质荷比的离子通过四极杆电场到检测器，其它离子不稳定而被吸收。将U2由低到高扫描就可按质荷比从小到大排列得到质谱图（五）质量分析器4．离子阱分析器（五）质量分析器离子阱分析器一般由一个环形电极和上下两个呈双曲面形的端盖电极围成一个离子捕集室。某一质量的离子在一定的电压下，可以处在稳定区留在阱内。改变电压后，离子可能处于不稳定区，振幅很快增长，撞击到电极即消失。在直流电压和射频电压比值不变时用射频电压扫描，即可以将离子从阱内引出获取质谱（五）质量分析器傅立叶变换离子回旋共振分析器（五）质量分析器原理：用线性调频脉冲来激发离子，在三对相互垂直的平行板电极中在磁场作用下作回旋运动、螺旋运动的频率与相应质量的离子数目成正比，得到质谱图特点：性能十分稳定可靠；可以和任何离子源相联，同时非常适合多级质谱。但是碰撞能量低，碎片不完全，需超导磁场，价格高傅立叶变换离子回旋共振分析器（五）质量分析器5.飞行时间分析器（五）质量分析器飞行时间分析器离子在加速电压V作用下获得电势能（zV）转化为动能：，以速度v进入到长度为L的离子漂移管(drifttube)或称飞行管，飞行时间为T，据T=L/v，两式合并后有：T=L(m/2zV)1/2即V、L恒定时，离子飞行时间T与其质荷比的平方根成正比。质荷比最小的离子最先到达检测器，最大的则最后到达，产生质谱。适当增加漂移管的长度可以增加分辨率212mvzV（五）质量分析器2020/2/26（六）检测器1．电子倍增器（最常用）由质量分析器出射的离子，具有一定的能量，打到电子倍增器的第一个阴极产生电子，电子再依次撞击电子倍增器的倍增极，电子数目呈几何倍数放大，最后在阳极上可以检测到放大后的电流。特点是快速、灵敏、稳定。2．光电倍增管离子发射撞击荧光屏，荧光屏发射光电子由电子放大器检测。电子放大器密封在容器中，光电子可穿透密封玻璃，能避免表面污染。二、质谱仪的组成（六）检测器3．电荷耦合器件（chargecoupleddevice，CCD）利用离子在感光板上的感光来观察质量谱线的位置和强度。CCD能检测出用一般电检测法难以检测到的极小量的试样和寿命短的离子。此外，离子阱、傅立叶变换器本身也就是一个检测器。还有离子计数器、法拉第杯、低温检测器等。二、质谱仪的组成2020/2/26（七）计算机系统运用工作站软件控制样品测定程序，采集数据与计算结果、分析与判断结果、显示与输出质谱图（表）、数据储存与调用等。二、质谱仪的组成质谱仪的结构质谱仪组成进样系统离子源质量分析器检测器1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光1.单聚焦2.双聚焦3.飞行时间4.四极杆显示真空系统三、质谱仪的分类按所使用的质量分析器类型来分类：•磁质谱仪（单聚焦质谱仪、双聚焦质谱仪）•四极杆质谱仪（Q-MS）•离子阱质谱仪（IT-MS）•飞行时间质谱仪（TOF-MS）•傅立叶变换质谱仪（FT-MS）按应用范围分类：•同位素质谱仪•无机质谱仪•有机质谱仪（如前面最基础的五类）质谱仪还可以按性能指标分类，如分辨率。（一）分辨率•是指分离相邻两个质谱峰的能力•公式一MRM12212MMMMMM，质谱图的分辨率示意图四、质谱仪的性能指标定义分辨率的公式•一般难以找到两个质量峰等高，同时谷高又刚好为峰高的10%•在这种情况下，可任选一单峰，测其峰高5%处的峰宽W0.05，即可当作上式中的ΔM，此时分辨率为0.05MRW一、分辨率（二）灵敏度•绝对灵敏度是指产生具有一定信噪比（signaltonoiseratio，SNR，S/N）的分子离子峰所需的样品量。常用绝对灵敏度表示质谱仪的灵敏度。其中，信噪比=检测信号∶背景噪音，一般要求信噪比大于10:1。•相对灵敏度是指仪器可以同时检测的大组分与小组分含量之比。•分析灵敏度则是指仪器在稳态下输出信号变化与样品输入量变化之比。四、质谱仪的性能指标GC-MS的灵敏度举例•通过GC