药品微生物限度与无菌检查方法验证实验的要点及体会

药品微生物限度与无菌检查方法验证实验的要点及体会中国药品生物制品检定所马仕洪北京2007年1月website:@nicpbp.org.cntel:010-67095509地址：北京市天坛西里2号邮编：1000502020/2/27中国药品生物制品检定所2一、方法验证实验的背景及程序•1、关于方法验证（背景）•2、方法验证实验的一般原则和程序2020/2/27中国药品生物制品检定所31、关于方法验证（背景）《中国药典》2005版国食监注〔2005〕234号“关于颁布和执行《中国药典》2005年版有关事宜的通知”国药典发〔2005〕98号“关于执行《中国药典》2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明”中检药〔2006〕862号“第七届全国药品检验所抗生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方法及标准研讨会会议纪要”2020/2/27中国药品生物制品检定所4为什么验证?•1）、采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生物检查作为整个药品质量体系中的一个环节，应与其他检验项目一样，对方法和条件进行考察，以保证结果的科学性，如鉴别、含量测定。•2）、验证的思想其实早已贯彻于微生物检测的诸多方面：无菌环境验证（尘埃离子、浮游菌、沉降菌检测）、灭菌器的验证、培养基灵敏度检测、阴性对照、阳性对照等等。2020/2/27中国药品生物制品检定所5为什么验证?•3）、2005版充分借鉴发达国家经验，将微生物检查方法的验证实验进行了更加系统化的规定和要求。验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判断没有影响。•4）、有了系统的方法验证，可以避免以往因为阳性菌选择不合理、方法不合理而造成的漏检、误判，以保证结果的科学可靠，这一点无论对于当前无菌检查的一次性报告，还是对于实验室认证认可、以及新的药品注册管理办法的要求都是相一致的。2020/2/27中国药品生物制品检定所6为什么验证？•5）、验证的必要性（质量控制的新手段）：不同企业以及同企业不同批次黄连上清丸稀释法的回收率比较试验结果，可能反映了不同黄连上清丸样品的质量差异。2020/2/27中国药品生物制品检定所7表5七企业黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果Tab1Recoveryofdilutemethodinmicrobiologicaltestofhuanglianshangqingwanfrom7corporations2020/2/27中国药品生物制品检定所8表6同厂不同批黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果（1：200）Tab2recovericeofdilutemethodinmicrobiologicaltestofhuanglianshangqingwanfromdifferentbatchsinsamecorporation(1:200)2020/2/27中国药品生物制品检定所92、方法验证实验的一般原则和程序•验证什么？•怎么验证？2020/2/27中国药品生物制品检定所10验证什么？•微生物检验：某种样品采用某种方法得到一个检查结果。What？①供试品影响②方法的有效性2020/2/27中国药品生物制品检定所11验证什么？需前处理不需前处理有抑菌作用无抑菌作用样品检查去除抑菌作用①验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。③验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污染菌生长、检出的影响。②可以通过验证实验判断图1药品微生物检查方法验证的一般程序与环节What？2020/2/27中国药品生物制品检定所12验证什么？——需要验证的重点环节•验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判断没有影响。•前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在验证范围内。已有标准规程（SOP）和充足实验证明的前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究提高。•供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。2020/2/27中国药品生物制品检定所13方法疑问实例——菌在何处？金葡10-6大肠10-6铜绿10-6枯草10-5白念10-5黑曲霉10-4不离心菌悬液计数3923471393100离心管上部菌悬液计数252362182731离心管中部菌悬液计数272040154733离心管下部菌悬液计数302149122764表710ml菌悬液500r/min离心5min离心后离心管不同部位菌悬液的计数结果（cfu/mL）•离心集菌法：500r/min离心5min×××r/min=×××g？2020/2/27中国药品生物制品检定所14怎么验证？•利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响，通过模拟实验对降低或消除效果加以检验。How?2020/2/27中国药品生物制品检定所15稀释法薄膜法中和法离心法供试品前处理去除抗菌活性稀释溶解分散萃取离心供试品污染微生物检查验证2020/2/27中国药品生物制品检定所16供试品中抗菌活性的去除•稀释法——降低供试品的相对浓度•薄膜法——利用体积差异分离•中和法——利用化学（生物）专属性灭活•离心法——利用沉降系数差异分离各方法组合运用，效果更佳！2020/2/27中国药品生物制品检定所17抗菌活性去除效果的检验•应根据供试品的特点，选择敏感菌株，对供试品抗菌活性去除效果加以检验（阳性菌的回收实验），再按药典要求全面验证，提高效率。2020/2/27中国药品生物制品检定所18选择敏感菌株间接方法——文献、技术资料（可靠）直接方法——预实验（体外抑菌实验）参考选择：一般中药选择枯草和金葡；一般抗生素根据抗菌谱选择。2020/2/27中国药品生物制品检定所19药物名称生产企业大肠金葡枯草白念黑曲抗栓再造丸辽宁华鑫药业有限公司100454610095更年安胶囊福州金象中药药业有限公司87954110091清热安宫丸江西国药药业有限公司88141510092通宣理肺丸广东阳江制药厂10059100100100肝德志胶囊四川省通阳制药厂936441100100宁心安神胶囊广西南宁万士达制药厂1007070100100防癌胶囊北京北卫药业有限公司35527010081肠胃舒胶囊北京北卫药业有限公司73224710086骨络通酒北京北卫药业有限公司10076110092消渴丸北京北卫药业有限公司9316710088鼻渊丸武汉中联药业集团公司80051100100陀螺银屑胶囊烟台中洲制药厂1007070100100冠心丹参胶囊内蒙古自治区包头制药厂8900100100龟龄集山西广誉远园药业有限公司1007070100100肚痛健胃整肠丸香港康恩堂制药厂837070100100冠心丹参胶囊长春海王生物制药有限公司1007070100100糖尿乐胶囊哈尔滨中药六厂有限公司1007070100100降糖宁胶囊通化茂祥制药有限公司1007070100100温胃舒胶囊江苏聚荣制药有限公司707070100100表8选择敏感菌株2020/2/27中国药品生物制品检定所20二、方法验证实验的几个要点•1、无菌检查法验证实验要点•2、微生物限度检查法验证实验要点•3、验证实验实例2020/2/27中国药品生物制品检定所211、无菌检查法验证实验要点•样品•菌种和实验用菌液•标准化操作•实验器材2020/2/27中国药品生物制品检定所22无菌检查样品无菌检查样品取样量（量）样品特性（质）抗菌活性剂型检验数量检验量侧重验证实验侧重无菌检查敏感菌选择去除抗菌活性方法选择前处理方法2020/2/27中国药品生物制品检定所23无菌检查样品•主要是取样量的问题•《中国药典》2005年版对无菌检查的“检验数量”和“检验量”作了明确的解释和规定。2020/2/27中国药品生物制品检定所24表2中上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量供试品装量V(ml)每支样品接入每管培养基的最少样品量最少检验数量(瓶或支)≤11V55≤V2020≤V5050≤V10050≤V100(静脉给药)100≤V≤500V500全量半量2ml5ml10ml半量半量500ml20*101010101066*每种培养基各接种10支供试品2020/2/27中国药品生物制品检定所25表3中上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量供试品装量M/支、瓶或个每支样品接入每管培养基的最小样品量最少检验数量（瓶或支）M50mg50mg≤M300mg300mg≤M5gM≥5g外科用敷料棉花及纱布缝合线、一次性医用材料带导管的一次性医疗器具（如输液袋）其它医疗器具全量半量150mg500mg取100mg或1cm×3cm整个材料*3整个器具*3（切碎或拆散开）20*1101010*21020*11020*12020/2/27中国药品生物制品检定所26表3注释•*1：每种培养基各接种10支供试品。•*2：抗生素粉针剂(≥5g)及抗生素原料药(≥5g)的最少检验数量为6瓶(或支)，桶装固体原料的检验数量为4个包装。•*3：如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。2020/2/27中国药品生物制品检定所27无菌检查样品三点体会：一是附录规定检验量的表格中不包括阳性对照用样品量，虽然附录另处有专门说明，仍然容易忽略；2020/2/27中国药品生物制品检定所28无菌检查样品三点体会：二是无菌检查时应强调“检验数量”，主要是保证实验结果的代表性，而阳性对照实验和验证实验仅须满足“检验量”总量要求即可，以检验样品对实验结果的影响，即保证实验结果的可靠性，验证实验可以由此减少大量的样品；2020/2/27中国药品生物制品检定所29无菌检查样品三点体会：三是对“检验数量”和“检验量”的把握应考虑便于实际操作，比如处理100ml/袋的样品，取9袋样品一次分配到一组三联滤器，“检验数量”大于药典规定的6个，但“检验量”似乎不符合药典规定的每袋样品取半量检验的规定，仅为1/3，但根据药典“检验量”即为“一次实验所用供试品的总量（g或ml）”的解释，这与先将6袋分配两个滤筒、再将剩下3袋抽入一个滤筒作为阳性对照的方法一样，却更节省时间。2020/2/27中国药品生物制品检定所30菌种和实验用菌液枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis[CMCC（B）63501]金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus[CMCC（B）26003]生孢梭菌Clostridiumsporogenes[CMCC（B）64941]铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa[CMCC（B）10104]大肠埃希菌Escherichiacoli[CMCC（B）44102]白色念珠菌Candidaalbicans[CMCC（F）98001]黑曲霉Aspergillusniger[CMCC（F）98003]2020/2/27中国药品生物制品检定所31菌种和实验用菌液•验证用菌种的保藏使用频繁传代限制（5代）2020/2/27中国药品生物制品检定所32菌种和实验用菌液菌种保藏及应用参考方法：干菌种（0代）100ml液体培养基复苏（1代）100ml液体培养基复壮（2代）加100ml20%无菌甘油混匀，1ml/管冻存管分装，-20℃或-80℃保存每次使用取1支自然（室温）解冻，取0.1ml接种至10ml液体培养基（生孢梭菌用12ml硫乙醇酸盐流体培养基）按规定培养、稀释（3代）注意：已经解冻的冻存管不能再冷冻保存，以免冻融！2020/2/27中国药品生物制品检定所33菌种和实验用菌液•各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。2020/2/27中国药品生物制品检定所34菌种和实验用菌液参考菌液制备标准程序：取经34℃培养18-24小时的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿假单胞菌与大肠埃希菌的营养肉汤培养物1ml，加入9ml0