实验四 包埋法固定SOD

实验十五：包埋法固定SOD及固定化酶性质测定一、实验目的要求了解酶的固定方法及其应用掌握包埋法制备固定酶的操作方法二、实验原理固定化酶(immobilizedenzyme):是指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。在理论研究上，固定化酶可以作为探讨酶在体内作用的模型;在实际使用中,可使生产工艺自动化和连续化，提高酶的使用效率。•酶的固定化技术：通过物理或化学的方法民间水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在一定的空间范围内进行催化反应。•固定化方法：吸附法固定化技术、包埋法固定化技术、结合法固定化技术、交联固定化技术•载体结合法①共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。②离子结合法通过离子效应将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上的一种方法。③物理吸附法将酶吸附到不溶于水的载体上而使酶固定化的方法。交联法利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯-马来酸酐共聚物等。参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。包埋法将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微囊中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。固定化酶的应用酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH值的变化，可制成机械性能好的颗粒装成酶柱用于连续生产，也可以制成酶膜、酶管等多种形式的酶反应器。固定化酶作为生物催化剂主要用于生产精细的特殊化学品、药品，在食品工业中由于生物催化剂较化学催化剂安全，也将得到广泛使用。同时，固定化酶用于各种疾病的诊断、治疗及人工脏器；用作化学分析的酶电极；固定化酶用作燃料电池；固定化酶用作亲和层析手段，分离和提纯酶的底物、辅酶、抑制剂及抗体等，显示出广阔的前景。本实验是用一定浓度的聚丙烯酰胺作为包埋剂，将SOD包埋在多孔的网状结构的聚丙烯酰胺凝胶内而制成固定化酶。SOD活力计算：对照OD值-样品OD值SOD活力(U/ml)＝x稀释倍数对照OD值*50％（每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位）2.球状固定化酶的制备：用取样器吸取50μL，分别滴加到白瓷板的20个孔中，待凝胶聚合。3.冲洗凝胶表面未固定化的SOD酶。用蒸馏水洗涤球状固定化酶3-5次。4.固定化酶活性测定：采用黄嘌呤氧化法测定SOD活力.测定原理通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基,后者氧化羟胺形成亚硝酸盐,在显色剂的作用下呈现紫红色,用可见分光光度计测其吸光度.当被测样品中含SOD时,则清除超氧阴离子自由基的作用,减少亚硝酸盐的形成.通过测定样品管和对照管的吸光度就可以计算出样品中的SOD活力.三、实验步骤1.22.5％聚丙烯酰胺固定化酶液配制：取一个EP管，按下表配制固定酶液（1ml）配制完后立即混匀试剂(ml)样品管对照管试剂一1.01.0样品加固定酶不加试剂二0.10.1试剂三0.10.1试剂四0.10.1充分混匀后,37度水浴40分钟,加显色剂22混匀,室温放置10分钟,波长550nm,蒸馏水调零,比色5.固定化酶热稳定性的测定取三支试管，分别加入SOD酶液5μL，蒸馏水5μL及10个球状固定化酶，放到75℃水浴保温10min。取出迅速冷却到室温。按上表各加入SOD反应液。测定OD值。四、实验结果与分析1.计算SOD固定化酶的活性2.计算热处理后固定化酶和游离酶的活性。3.SOD固定化酶活力损失多少。4.比较固定化酶和游离酶对热的抗性情况。