免疫细胞的分离技术2011

一、免疫细胞的种类与特征二、免疫细胞的分离技术三、免疫细胞分离的临床意义第三节免疫细胞的分离技术免疫系统的组成免疫系统免疫器官中枢:胸腺、骨髓周围：淋巴结、脾脏、粘膜相关淋巴组织等免疫细胞：淋巴细胞、单核-巨噬细胞、粒细胞、DC、肥大细胞、NK细胞免疫分子：抗体、补体、细胞因子、MHC、TCR、粘附分子等Innateimmunity固有免疫定义：人类在种系进化过程中形成的、经遗传获得的免疫，遇病原体后首先并迅速起防卫作用的免疫应答组成：皮肤、粘膜及其产物、细胞（NK细胞、单核-吞噬细胞、DC、NKT、中性粒细胞、T细胞、B1细胞）等特点：先天具有、无潜伏期、无特异性、无记忆性作用时间：0-96小时Adaptiveimmunity获得性(适应性)免疫定义：机体在生活过程中，因接触抗原性物质而获得的免疫。T、B细胞识别病原体成分后产生的免疫应答特点：后天获得、有潜伏期、特异性，记忆性参与细胞：T细胞和B细胞起作用时间：晚，一般在感染后4-5天发挥作用一、免疫细胞的种类与特征免疫细胞的分类根据免疫细胞在免疫应答中的作用可分为三类免疫活性细胞(immunocompetentcells)抗原提呈细胞(antigen-presentingcells,APC)其他细胞凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，通称为免疫细胞（immunocyte），其中包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞DC、肥大细胞、粒细胞等免疫细胞的起源与分化免疫活性细胞具有特异性抗原受体、在接受抗原刺激下发生克隆性活化、增值和分化，产生适应性免疫应答（adaptiveimmuneresponse)的细胞。这类细胞是机体产生特异性免疫应答的基础，包括T细胞、B细胞抗原提呈细胞（antigenpresentingcell,APC）加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的一组免疫细胞。血液中主要的APC细胞主要包括单核细胞、树突状细胞、B细胞其他细胞自然杀伤(NK)细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，血小板等NK细胞肥大细胞嗜酸性粒细胞嗜中性粒细胞嗜碱性粒细胞血小板免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征理化性状生物学特性免疫细胞的特征2、免疫细胞的表面分子特征：白细胞分化抗原指血细胞分化成熟为不同谱系、分化的不同阶段以及细胞活化过程中,出现或消失的细胞表面标记分子聚类分化群(分化抗原，clusterofdifferentiation，CD)：应用单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原称为CD抗原CD抗原常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志人CD分组分组CD（举例）T细胞CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD152(CTLA4)、CD154(CD40L)、CD272(BTLA)、CD278(ICOS)、CD294(CRTH2)B细胞CD19、CD20、CD21、CD40、CD79a(Ig)、CD79b(Ig)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)髓样细胞CD14、CD35(CR1)、CD64(FcRI)、CD256(APRIL)、CD257(BAFF)、CD312(EMR2)血小板CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v)、CD61(整合蛋白3)、CD62P(P选凝素)NK细胞CD16(FcRIII)、CD56(NCAM-1)、CD94、CD158(KIR)、CD161(NKR-P1A)、CD314(NKG2D)、CD335(NKp46)、CD336(NKp44)、CD337(NKp30)非谱系CD30、CD32(FcRII)、CD45RA、CD45RO、CD46(MCP)、CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、CD279(PD1)、CD281CD284(TLR1-TLR4)、CD289(TLR9)、CD305(LAIR-1)、CD306(LAIR-2)、CD319(CRACC)人CD分组分组CD（举例）黏附分子CD11a-CD11c、CD15、CD15s(sLx)、CD18(整合蛋白2)、CD29(整合蛋白1)、CD49aCD49f、CD54(ICAM-1)、CD62E(E整合蛋白)、CD62L(L整合蛋白)、CD324(E-cadherin)、CD325(N-cadherin)、CD326(EpCAM)细胞因子/CD25(IL-2R)、CD95(Fas)、CD116-CDw137、CD178(FasL)、趋化因子受体CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD195(CCR5)、CD261CD264(TRAIL-R1TRAIL-R4)内皮细胞CD105(TGF-RIII)、CD106(VCAM-1)、CD140(PDGFR)、CD144(VE钙黏蛋白)、CD299(DCSIGN-related)、CD309(VEGFR2)、JAM1(CD321)、JAM2(CD322)碳水化合物结构CD15u、CD60aCD60c、CD75、CDw327CDw329(siglec6、7、9)树突状细胞CD85(ILT/LIR)、CD273(B7DC)、CD274CD276(B7H1-B7H3)、CD302(DCL1)、CD303(BDCA2)、CD304(BDCA4)干细胞/祖细胞CD133、CD243基质细胞CD292(BMPR1A)、CD293(BMPR1B)、CD331CD334(FGFR1FGFR4)、CD339(Jagged-1)红细胞CD233CD242二、免疫细胞的分离技术（一）外周血单个核细胞分离（二）T淋巴细胞及其亚群的分离（三）B淋巴细胞及其亚群的分离（四）Mo/Mø分离技术（五）NK细胞的分离技术免疫细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法免疫细胞的分离技术1、密度梯度离心法2、黏附分离法（尼龙毛法、贴壁法、亲和板法）3、磁性分离法4、荧光激活分离法5、其他分离法（花环沉降法）（一）外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是根据不同细胞密度不同的分离法不同细胞密度不同单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.077左右人的红细胞密度为1.093，1.077粒细胞密度为1.092，1.077血小板密度1.077肝素抗凝静脉血与等量Hank’s液或PBS混匀沿管壁缓慢叠加于Ficoll分层液面上水平离心2000rpm×20min离心后管内分三层，用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞洗涤细胞两次RPMI1640重悬细胞台盼兰染液混合计数细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色活细胞数活细胞百分率＝──────×100％总细胞数方法用本法分离PBMC，一般纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上（二）T淋巴细胞及其亚群的分离T淋巴细胞亚群•T细胞的发育阶段分类•表达TCR的类型分类•是否表达CD4或CD8•T细胞功能分类T淋巴细胞亚群•T细胞的发育阶段分类初始T细胞naiveTcells未经抗原刺激的成熟T细胞，表达CD45RA效应T细胞effectorTcells表达高亲和力IL-2R，介导免疫效应记忆T细胞memoryTcells表达CD45RO，介导再次免疫应答T淋巴细胞亚群•表达TCR的类型分类TCRαβ+T细胞TCRγδ+T细胞T淋巴细胞亚群•是否表达CD4或CD8CD4+T细胞CD8+T细胞T淋巴细胞亚群•T细胞功能分类辅助性T细胞HelperTcells,Th效应T细胞EffectorTcells,TE细胞毒T细胞CytotoxicTlymphocytes,CTL迟发性变态反应T细胞DelayedTcells，Td初始T细胞NaiveTcells调节性T细胞RegulatoryTcells，Tr记忆T细胞MemoryTcells，Tm抑制性T细胞SuppressorTcells，Ts辅助性T细胞HelperTcells,ThTh1:细胞免疫Th2：体液免疫Th17：炎症反应辅助性T细胞HelperTcells,ThTGF-+IL-6辅助性T细胞HelperTcells,Th•滤泡辅助性T细胞（Tfollicularhelper，Tfh）通过细胞因子IL-10和IL-21来调节B细胞的功能CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的分化Foxp+T调节细胞可以从胸腺直接分化，也可在TGF-作用下从Foxp3-T细胞分化。调节性T细胞RegulatoryTcells，Tr玫瑰花结法（E花环沉降法）尼龙毛柱分离法淘洗法免疫磁珠法流式细胞术分选法（二）T淋巴细胞及其亚群的分离人T淋巴细胞表面表达CD2分子，即绵羊红细胞受体，B细胞则无。在适当的条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结（rosette）,因为红细胞环绕T细胞，形似花环，所以又称E-花环（E-rosette）该实验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况玫瑰花结法淋巴细胞+SRBC悬液→37°C水浴10min→低温低速离心→T细胞形成E花环而沉于管底→悬液中为B细胞。方法混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而T细胞不与尼龙毛粘附的特性，这是获得富含T细胞群的有效方法尼龙毛柱分离法•简单，快速，经济，尼龙毛可反复利用•可分离大量细胞•细胞不会被激活，可用于功能测定•纯度不高•耗时优点缺点也叫亲合板结合分离法(immunepanningisolation）。利用亲合层析和抗体固相包被原理，将相应抗体结合于塑料平板上，由于各种淋巴细胞亚群具有不同抗原性的特点和表面标志，加细胞悬液后，凡抗原阳性的细胞则与相应的固相抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取同理若用特异性抗原交联于塑料板上，则可分离得到具有特异抗原受体的淋巴细胞。但淋巴细胞受体与特异抗原或抗体连接后有可能引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更合适淘洗法亲和板分离淋巴细胞示意图•利用T淋巴细胞表面某种标志性抗原与包被在固相载体上的特异性单抗结合，将T细胞与其他细胞分离的方法T淋巴细胞淘洗分离原理1.羊抗兔Ig包被平皿2.CD4一抗培育T细胞，倒入平皿，4℃孵育1小时；3.收集未粘附的CD4-T细胞4.PBS漂洗非特异吸附的CD4-T细胞5.收集粘附的CD4+T细胞，可以用刮板刮取并在显微镜下观察方法（以CD4+T细胞为例）免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离免疫磁珠法（Magneticactivatedcellsorting,MACS）NS阳性选择法（正选）NS阴性选择法（负选）免疫磁珠细胞分选装置•将特异性抗T细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合T细胞•在磁场中，结合T细胞的免疫磁珠固定了，未结合的其它细胞被洗脱下来•撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱T细胞免疫磁珠法阳性选择T细胞•将多种特异性抗非T细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合非T细胞•在磁场中，结合其它细胞的免疫磁珠固定了，未结合的T细胞被洗脱下来免疫磁珠法阴性选择T细胞CD4