感染性疾病的分子诊断

第八、九章感染性疾病的分子诊断感染的慨念感染是病原体和人体之间的相互作用过程病原微生物：致病菌（条件致病菌）微生物人体微生物人体不同的感染状态共生状态在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生感染性疾病：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病。病原体：病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、寄生虫。常规检测方法：•免疫学方法•微生物学方法受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信息。感染性疾病的分子诊断策略•一般性策略（检出病原体）：–判断有无感染–是何种病原体感染–常用方法：PCR＋杂交•完整性策略：–检出病原体–分型（分类）－亚型－耐药性–常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序感染性疾病分子诊断标志物•病原体核酸分子（DNA/RNA）•基因表达产物•代谢物•免疫应答分子细胞免疫体液免疫TT致敏T细胞淋巴因子B浆细胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出现临近恢复期出现与原虫和蠕虫感染有关二、感染性疾病分子诊断的常用方法根据目的基因是否被放大，可分为杂交法和扩增法。•信号放大技术检测方法靶分子数目不变，而检测的探针信号放大采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探针标志物的浓度使检测信号得到放大。•靶分子扩增技术检测方法靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增•PCR、替代扩增、LCR等引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNAcDNA模板5'5'3'3'5'3'引物BRNAseHRTT7RNA聚合酶100-1000RNA扩增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A3'5'5'RNAseHRNARNAcDNAcDNA图8-3NASBA原理示意图引物A5’端带有T7RNA聚合酶结合位点，3’端碱基与靶RNA3’端序列互补;引物B的碱基序列与cDNA3’端序列互补nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)•NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNAcDNA模板5'5'3'3'5'3'引物BRNAseHRTT7RNA聚合酶100-1000RNA扩增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A3'5'5'RNAseHRNARNAcDNAcDNA图8-3NASBA原理示意图引物A5’端带有T7RNA聚合酶结合位点，3’端碱基与靶RNA3’端序列互补;引物B的碱基序列与cDNA3’端序列互补nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)•NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。三、感染性疾病分子诊断的标本处理•标本采集处理主要包括选择合适的标本种类、标本量、抗凝剂等及对标本进行合适的传送、保存和预处理。四、感染性疾病分子诊断的结果解释1.阴性结果假阴性可能性方法的灵敏度太低方法失败目标分子2.阳性结果假阳性可能性方法的特异性受到污染3.定性检测结果有时不能提供病原体活力相关信息临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样本中仍可以检测出相应的病原体。有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。4.疾病状况的判断检测出病原体的存在并不能说此病原体就是引起疾病的直接原因。该病原体可能是一种正常菌群五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评价•用于感染性疾病治疗的监控和预测、病情发展过程的危险性评价及疾病预后等。•耐药性的检测•细菌的分型•流行病调查第一节病毒的基因检测人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾病的75%左右。400多种不同病毒。病毒结构：大小：20-300nm核心区：核酸（DNA或RNA）外周衣壳：蛋白质包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）我国是HBV高流行区，50%－70%的人受过感染，8%－10%是HBV携带者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬变，HBV又与原发性肝癌密切相关。外壳（HBsAg):外壳蛋白成分为表面抗原核心（HBcAg)：DNADNA聚合酶HBcAg一、乙型肝炎病毒Dane颗粒（完整的病毒）形态HBsAgHBcAgHBVDNADNAPol（外膜蛋白）（核衣壳蛋白）完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米由双层外壳和一个核心组成的，核心直径为27纳米，内含DNA双链和DNA多聚酶（一）病毒基因组结构•3.2kb双链DNA病毒•不完全双连环状DNA长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、XS区编码外膜蛋白（HBsAg）C区编码HBeAg、HBcAgp区编码DNA聚合酶X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表达有关。短链S为正链：长短不一pre-s1pre-s2SPCpre-cXHBVDNA3.2kbpre-S1pre-S1蛋白pre-S2pre-S2蛋白SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAgHBV基因组结构HBV基因分型•HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型：–A型主要存在于白人，–B型和C型主要存在于亚洲人群–E型主要存在于西非–F型仅见于中南美洲的土著人–G型和H型很少见•不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有较高比例的D型HBV在肝细胞内的复制A(n)mRNAcccDNAHBsAg包膜负链DNA包裹后的前基因mRNA传染性HBV病毒颗粒传染性HBV病毒颗粒部分双链DNA逆转录酶DNA聚合酶肝细胞（二）分子诊断•常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存在窗口期，不易早期诊断。1.PCR采用普通PCR、FQ-PCR、竞争性PCR、免疫杂交PCR，可提供直接、准确的病原学诊断证据。引物是根据S、C、P、X基因中高度保守序列设计，决定扩增的特异性和敏感度。扩增位置引物序列扩增片断（bp)P、X基因5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’C基因5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’C基因5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’有时为了证实扩增产物的特异性，对扩增产物进行以下分析：•RLFP•斑点杂交•Southern杂交2.支链DNA信号放大技术(bDNA）•原理:①捕获探针检测②靶探针1体系③靶探针2④bDNA分子:DNA主链上结合多个侧链•捕获探针固化在微孔板上靶探针1分别与捕获探针及待测核酸杂交靶探针2分别与待测核酸及bDNA杂交形成复合物：固相支持物捕获探针靶探针1CEs待测核酸靶探针2LEsbDNA复合物分支链DNA信号放大技术(bDNA)•信号检测：bDNA可结合很多酶标探针，酶催化底物（1,2-二恶二酮，dioxetane）发光，使核酸信号放大，且发光强度与DNA量成正比。•优点：放大倍数确定阳性检出率高稳定性和可重复性好操作简便，省时，易于普及3.基因芯片技术标本经PCR扩增后与芯片上的特异探针进行杂交，可以检测：是否有病毒感染感染病毒的种类及亚型病毒的耐药情况特点：可同时进行大量标本的检测近年来陆续上市的核苷(酸)类似物对HBV的治疗压力集中在P区。干扰素治疗对HBV的压力主要集中在前C/C区及前S区。HBV耐药突变lamivudineadefovirentecavirtelbivudineYMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)•HBV对拉米夫定耐药是HBVDNA聚合酶突变所致。•耐药基因位点(YMDD)位于聚合酶的C区(rtM2041或rtM204V)，分别是YMDD中的蛋氨酸(M)被异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)所替代，形成YIDD或YVDD变异.•拉米夫定作用靶位为HBVDNA聚合酶C区。有研究表明，拉米夫定与HBV逆转录酶的亲和力与位于第552位氨基酸侧链长度有关，异亮氨酸和缬氨酸取代蛋氨酸，使侧链氨基酸长度缩短，使逆转录酶dNTP结合区增大，不适于拉米夫定结合，从而诱发耐药性。HBV耐药检测（YMDD突变检测方法）YMDD突变检测方法•1.基因测序法•2.荧光定量PCR方法–基本原理•确定探针特定的TM值来区分是否突变–常用方法•覆盖突变位点荧光双探针杂交YIDDYMDDYVDD46.91℃54.64℃50.74℃（三）临床意义1.早期诊断免疫学检测敏感性：0.1µg/ml核酸杂交检测敏感性：0.1pg/mlPCR检测：0.1fg/ml因此，在感染早期即可通过DNA检测证实病毒的存在。2.监测治疗效果:•HBVDNA107拷贝/ml提示病毒复制活跃；•HBVDNA＜104拷贝/ml治疗有一定疗效；•HBVDNA＜103拷贝/ml、HBeAg阴转、转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标；3.判断病情，指导制定合理的治疗方案4.病毒耐药性的检测•乙肝病毒DNA聚合酶YMDD处的突变是病毒产生耐药性的重要原因，通过监测YMDD的突变情况，可以获得病毒耐药性方面的信息，指导抗病毒治疗。二、流行性感冒病毒•流行性感冒病毒(Influenzavirus)，是引起流行性感冒的病原体;•分为甲(A)、乙(B)和丙(C)3个型别;•根据病毒颗粒表面血凝素(Haemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲型流感病毒又可分为不同的亚型。•甲型流感病毒易发生变异，致病力强，1918年发生在西方国家的大流感杀死了几千万人，即是由甲型流感病毒引起。Thereare16differentHantigens(H1toH16)andninedifferentNantigens(N1toN9).（一）流感病毒基因组结构•单链RNA病毒，RNA为负链；•有8个RNA片段或7个RNA片段；•所有RNA片段5’末端和3’末端高度保守；•两种不同亚型病毒感染宿主时，会生成基因重配的新病毒；•RNA基因在复制过程中常会发生点突变。•（二）分子诊断方法•可采用RT-PCR、FQ-PCR检测流感病毒RNA。引物常按流感病毒保守的非结构基因（NS）的序列进行设计。•为证实PCR扩增产物的特异性或提高检测的灵敏度，可用限制性内切酶分析法、斑点杂交法、Southern印迹法进行扩增产物的分析。扩增位置引物序列扩增片段大小NS基因•5’-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3’190(bp)•5’-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3’NS基因•5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)•5’-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3’（三）临床意义•流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔培养和血清学血凝抑制试验，这些方法比较费时，灵敏度低，难以作出早期诊断。•PCR法敏感、特异、简便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病学调查。三.人类免疫缺陷病毒（HIV)•HIV，humanimmunodeficiencyvirus•AIDS，acquiredimmunodeficiencysyndrome•HIV为艾滋病的病原体。现已发现引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三种。•1998年底艾滋病感染者和艾滋病患者总数为3.340万，已死亡1.390万，是全球十大主要死因之一。•最外层为囊膜，双层脂蛋白，是病毒识别攻击宿主细胞所必不可少的；其内为核衣壳。2.基因组结构•逆转录病毒，两个拷贝的单股正链RNA；•每个RNA长约9.7Kb，有5’