3-色谱分析样品的预处理技术

色谱分析样品的预处理技术先看一典型例子-瘦肉精分析瘦肉精(盐酸克仑特罗)是白色或类白色的结晶性粉末，无臭，味苦。由于本品化学性质稳定，加热到172℃时才分解，因此一般加热方法不能将其破坏。该化合物易溶于水,以及热乙醇，不溶于乙醚。而其游离形式能溶于乙醚或乙酸乙脂等有机溶剂。应用这一特点建立一个较理想的提取过程。但预处理过程相当繁琐:NHR5OHR1R2R3R4直接法预处理称样20.0g（经粉碎的样品）加提取溶液0.1mol/L盐酸溶液50ml匀浆5分钟2万转/分钟超声波萃取（超声波震荡5分钟）离心（10分钟10000转/分）留取上清液丢弃沉淀物或从新提取一次对动物组织可加热处理直接法预处理（接上）调整pH值(用40%NaOH溶液pH至10~12)30ml乙醚脱脂（1-2次）水相用乙酸乙酯萃取3次合并有机相将有机相抽真空旋转蒸发至近干丢弃乙醚层丢弃水层用2mL3%乙醇乙酸乙酯溶液溶解直接法预处理（接上）上SCX柱用10mL95%乙醇洗脱在氮吹仪吹干加入流动相2.0ml混匀离心5分钟（10000转/分）上清液HPLC进样必须提请注意:任何实际样品都是十分复杂的，从采集到能进仪器检测都必须经复杂预处理过程。预处理需要精心设计，针对不同样品有的放矢。预处理有很多类型，往往需要综合利用。每步预处理都涉及回收率，都不能低。每步都需要有量的概念，算好稀释浓缩的总比例。一、萃取分离萃取技术是石油、化工、医药、生物、环保、新材料等众多领域中常用的分离技术，主要有液液萃取和固液萃取,其中：液液萃取——分普通溶剂萃取、超临界流体萃取、反胶团萃取、双水相萃取等;固液萃取——分提取（抽提）、固相萃取、固相微萃取等1、常规液-液萃取液-液萃取分离技术处理能力大，分离效率高、回收率高，经济性好，适应性强。过程：两种互不相溶的溶剂与含被分离组分的试液一起振摇，而后分层。本质：萃取分离就是传质的过程，即将物质由亲水性转化为疏水性的过程。将物质由疏水性转化为亲水性的过程称为反萃取。亲水性强弱的规律：1）凡离子均亲水——不能被萃取2）物质含亲水基团越多，其亲水性越强；－OH，－SO3H，－NH2，NH。3）物质含疏水基团越多，相对分子量越大，其疏水性越强。－CH3，－C2H5，卤代烷基等;芳香基如苯基、萘基等。液-液萃取的特点液-液萃取分离技术处理能力大，分离效率高、回收率高，经济性好，适应性强。主要适用于：各组分沸点相近或易成共沸物精馏不适用时;含有高沸点组分精馏能耗太高时;精馏时易分解、聚合或发生化学变化时;溶液浓度太低时;溶液中含有溶解或络合的无机物;溶液中含有极难分离的金属时;……液-液萃取的类型简单分子萃取：简单的物理分配过程，溶剂与被分离组分不发生化学反应（单质碘在水-CCl4中）。螯合物萃取：萃取剂和被萃取物形成中性溶剂螯合物而进入有机相(萃取溶剂)。离子缔合物萃取：被分离物形成络阳离子或络阴离子后与体系中的异电荷离子缔合而进入有机相。酸性磷类化合物萃取：以含酸性基团的有机磷化合物为萃取剂，通过其氢离子与水溶液中的金属离子相互交换而进行萃取。1、常规液-液萃取萃取剂——①至少有一个萃取功能基（O、N、P、S等），②必须有较大的烃基链。同时希望有选择性好、稳定、易分层、操作安全、环境友好等特点。萃取溶剂——溶解被分离物质与萃取剂形成的各类物质。萃取剂和萃取溶剂有时为同一物质。萃取溶剂的选择主要指标是与样品的不混溶性和极性。一般优先选择低溶解性、易挥发的溶剂水溶液非水有机溶剂水溶液非水有机溶剂纯水酸性溶液碱性溶液脂肪烃醇、醚二氯甲烷、氯仿乙酸乙酯等酯类高盐上述两种或以上混合液脂肪酮、脂肪醇甲苯、二甲苯或组合萃取结果评价：单次萃取百分率：100%WODEDVV反萃时：100%OWDEDVV多次萃取百分率：1100%nWOWVEDVV提高萃取效率和选择性的途径不同萃取体系对相应条件的要求不同，提高选择性的方法也不同。对螯合物萃取体系，可通过①改变酸度——pH增加1，Ｍn＋的分配比增加10n倍)②提高萃取剂浓度——D=Kex[HA]On/[H+]n③选择合适的萃取溶剂——相似相溶原则④选择合适的掩蔽剂——除去干扰离子的影响⑤利用协同效应——多元配合物有协同效应⑥利用共萃取或反萃取——一定的富集和分步处理⑦改变元素价态——减少干扰2、连续液-液萃取K值比较小或需处理的样品量大时，多次萃取不实际。可考虑多用连续萃取法。溶剂密度大于萃取原液时，溶剂受热上行，冷凝后滴回管中，与水相作用，因溶剂比水重，下沉，最后回到烧瓶中，得到浓缩。2、连续液-液萃取当溶剂的密度小于萃取原液时，套上图中的小漏斗，并把底部的活塞关上，溶剂将经上出口回流到烧瓶，经过加热烧瓶，可以使溶剂循环使用方法特点优点：无需人操作，操作可使用较少的溶剂而得到较高的萃取效率。缺点：易挥发组分要有损失。热不稳定化合物将会降解。3、逆流萃取可提供1000或更多的塔板数用于萃取分离，但耗时也长。原理上讲，可以看成是在一系列的分液漏斗进行，样品被引入到分液漏斗的上层液相，平衡后转入第二漏斗，然后引入新的上层溶剂相到第一漏斗。重复进行即可。逆流萃取类似于低分辨率柱色谱，目前是一种常用的制备技术。高速逆流色谱(High-SpeedCounterCurrentChromatography，)高速逆流色谱液-液分配色谱20世纪80年代，由YoichiroIto研制开发特点：两个互不相混的溶剂逆向流动，样品在两相之间分配，不用固态吸附剂的全液态的色谱方法。工作原理：螺旋管作同步行星式运动利用螺旋管柱在行星运动时产生的离心力分离原理：在一缠绕的螺旋空管内，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后作行星运动；同时由恒流泵不断注入载着样品的另一相(流动相)，由于行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。样品中各个组分依据它在两相中的分配系数的差异实现分离，以达到分离的目的。下相(重相)作流动相时管柱里溶剂的状态：混合区：靠近中心轴的近1/4的区域，两相剧烈地混合；沉积区：两相分成两层，重相占据螺旋管每一段的外部，轻相占据每一段的内部。高速逆流色谱仪系统洗脱次序：在流动相中分配比例大的组分先被洗脱出来，而在固定相中分配比例大的组分后被洗脱。假定各组分在上层相(UP)和下层相(LP)的浓度比(分配系数){CB(UP)/CB(LP)}的大小次序如下：fedcba若上层为流动相，下层为固定相，则分离效果为：fedcbaHSCCC系统示意图分析型半制备型制备型HSCCC的优点不存在样品的不可逆吸附；样品可定量回收。极大地控制了样品的失活和变性等问题，样品不会遭到破坏。分离量较大，分离效率高，分离结果能达到相当高的纯度。高速逆流色谱条件的选择固定相保留率越高，分离效果也越好！！溶剂系统应满足以下要求：(1)样品在溶剂系统中有足够高的溶解度，且不造成样品的分解、变性等问题。(2)样品中各组分在溶剂系统中的分配系数值范围为0.52。(3)为了保证固定相能实现足够高的保留，溶剂系统的两相分层时间尽可能小于30秒。(4)溶剂系统上下两相的体积大致相等，以免浪费溶剂，而且尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理，易于物质的纯化。常用溶剂系统根据组分的极性和溶解性疏水性更强的体系，可以用乙醇代替甲醇；亲水性较强的体系，可加入乙酸铵等盐类物质，或者三氟乙酸或乙酸等有机酸。螺旋管转速与固定相保留率螺旋管的旋转速度对两相的混合程度具有决定性的影响作用，同时旋转速度所产生的离心力场对固定相的保留也具有决定性的影响作用。两相分布与螺旋管转速的关系图：高表面张力的溶剂系统：使用较高的转速，以使两相之间有剧烈的混合而促进分配和减少质点传递的阻力。低表面张力的溶剂系统：使用较低的转速，避免过分的混合作用引起样品区带沿螺旋管长度的展宽和乳化作用的固定相流失。固定相保留率固定相的量是影响溶质峰分离度的重要因素。高固定相保留率会大大提高峰的分离度。溶剂系统的物理特性如表面张力、粘度和两相之间的密度差与固定相的保留值有密切关系。在溶剂系统的各个物理量中，粘度对固定相的保留值起主要的影响作用，低粘度的溶剂系统可望得到高的固定相保留率，而高粘度的溶剂系统的固定相保留率较低。通常应尽量加大两相密度差和减小粘度。HSCCC与HPLC的比较两法互为补充，其分离效率虽不能与分析型HPLC相比，但可与制备型相媲美。不用固体支撑体，避免了样品的不可吸附、失活和变性等有广泛的龙两相溶剂供选择，大大增加了适用范围就制备量而言，操作成本低操作灵活，固定相和流动相可互换使用HSCCC在分离纯化药用成分的应用生物碱：黄柏中的小檗碱和巴马亭；高乌头中的刺乌头碱、小乌头碱、去乙酰刺乌头碱，长春花中的长春花碱、长春朵灵、长春花朵灵、泻花碱，川芎中的川芎嗪等；黄酮类：葛根中的葛根素，木蝴蝶中的黄芩素，黄芩中的黄芩苷，黄芪中的毛蕊异黄酮，银杏黄酮，大豆异黄酮等；多酚类：绿茶中的儿茶素，虎杖中的白藜芦醇、白藜芦醇苷，红茶中的茶黄素，红景天苷，金银花中的绿原酸等；HOOHOOHOHOH(-)ECNOCH3OCH3OOOH+-小檗碱黄芩素OOHOHOOH醌类：大黄中的大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚，虎杖中的花色素A、花色素B等；香豆素类：羌活中的羌活醇、异前胡醚，补骨脂中的补骨脂素、异补骨脂素，白芷中的欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素等；木脂素类：厚朴中的厚朴酚，牛蒡子中的牛蒡子苷，五味子中的-五味子素、去氧五味子素；萜类：白芍中的芍药苷，穿心莲中的穿心莲内酯、新穿心莲内酯，番茄红素，叶黄素等。皂苷类：三七中的三七皂苷。OOOH蒽醌OOHO香豆素OHOH木脂素绿茶中儿茶素的分离和纯化HOOHOOOHOHOHCOOHOHOHACBDHOOHOOOHOHOHCOOHOHOHACBD(-)EGCG(-)GCGHSCCC条件：溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-水(1：10：10，V/V)上相为固定相，下相为流动相。流动相流速：3.5mL/min转速：800r/min紫外检测波长：280nmHOOHOOHOHOH(-)ECHOOHOOOHOHCOOHOHOH(-)ECGHOOHOOHOHOHOH(-)EGCHPLC纯度98%茶多酚中儿茶素分子的结构修饰OOHHOOCOOHOOHOHOHOHC(CH2)14CH3O76510432981'2'3'4'5'6'7123456ACBD0123450.00.51.01.5654321吸光度Absorbance/AU时间Time/hHSCCC条件：溶剂系统：正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水(1：1：1：1，V/V)下相为固定相，上相有机相为流动相。流动相流速：3.2mL/min转速：750r/min紫外检测波长：280nm固定相保留率：69%峰3组分JournalofChromatographyA,2002,982(1),163-165茶叶科学，2003，23(2)，115-118藤茶提取物中类黄酮苷的分离JournalofChromatographyA,2004,1040,147-149HSCCC条件(型号：GS-10A，柱容量：280mL)溶剂系统：正己烷:乙酸乙酯:甲醇：水(1:6：1.5:7.5，V/V)上相为固定相，下相为流动相。流动相流速：1.5mL/min转速：750r/min紫外检测波长：254nm固定相保留率：45%杨梅苷(Myricitrin)虎杖提取物中白藜芦醇的分离min0510152025mAU020406080100120VWD1A,Wavelength=303nm(RES00074.D)#No.24Resveratrol8.297min051015202530mAU02.557.51012.51517.520VWD1A,Wavelength=303nm(RES00072.D)ResveratrolNo.16#8.311HSCCC条件：溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-乙醇-冰乙酸-水(1