造血干细胞移植讲解

造血干细胞移植造血干细胞移植(SCT)按其干细胞的来源,分为：（1）自体造血干细胞移植(ASCT)（2）同种异基因造血干细胞移植(Allo-SCT)（3）异种造血干细胞移植(SCT)。根据干细胞采集的部位又可分为：（1）骨髓移植(BMT)（2）外周血造血干细胞移植(PBSCT)（3）脐血造血干细胞移植(NCSCT)（4）胎肝造血干细胞移植(NLSCT)骨髓移植骨髓移植(简称BMT)是指对病人实施免疫抑制处理后,使机体失去排斥异体组织的能力,通过移植骨髓中的多能造血干细胞给病人,以重建造血和免疫功能,从而达到治愈某些疾病的一种方法。一、骨髓移植种类根据骨髓的不同来源,可将骨髓移植分为：自体骨髓移植(ABMT)同种异基因骨髓移植(Allo-BMT)同种同基因骨髓移植(SBMT)异种骨髓移植(一)自体骨髓移植(ABMT)取患者自身骨髓进行保存。在其相应时间内,用大剂量的放疗和/或化疗,最大限度地杀伤患者体内的肿瘤细胞,然后再输回自体骨髓,恢复患者造血功能。此种移植不会出现排斥和移植物抗宿主病(GVHD)等严重合并症,骨髓移植容易植活，但极易复发。ABMT时必须注意以下几个方面:①肿瘤必须未累及骨髓,移植前骨盆未受过射线照射。②年龄不宜过大。③肿瘤必须对放、化疗敏感。④自体骨髓移植有利于保护骨髓,免受放、化疗影响。⑤不能防止放、化疗对心、肝、肾等脏器的毒性损害。⑥自体骨髓成功的关键是：保存造血干细胞的活力和基本功能。骨髓采集后如置于常温下,骨髓在培养液或保存液内最长不能超过72小时。因此大剂量放、化疗须在短时间内完成,或者有时难以忍受。在-196℃长期保存。⑦对缓解期肿瘤(尤其是血液系统的白血病和多发性骨髓瘤)进行BMT,采集的骨髓最好能行体外净化,去除残存的肿瘤细胞,否则移植后复发率极高。⑧移植后不出现GVHD,就不会出现抗肿瘤效应,故复发率极高。（二）同种同基因骨髓移植(SBMT)在人类仅限于同卵双胎间的移植,这种机会极少。因无供受者间免疫方面的障碍,无需免疫抑制处理,也不会出现排斥和GVHD,因而临床效果较好。倘若用于治疗白血病、多发性骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤,移植后复发率比Allo-BMT要高,这可能与缺乏移植物抗肿瘤效应作用有关。（三）同种异基因骨髓移植(Allo-BMT)是指供一受者之间主要组织相容性复合物(简称MHC)相合的同种两个个体间的移植。目前开展的是基因型相同或基本相同的兄弟姐妹间的移植,少数为亲子间的移植,也有人类白细胞抗原(简称HLA)表型相同的无关人员之间移植，此种移植机会极少。易并发GVHD,但其优点是移植后疗效比ABMT和SBMT佳。二、供受者选择:（一）受者(患者)选择应注意:(1)年龄控制2～50周岁。(2)选择合适的移植时机,如：急淋高危组和急非淋CR1后,低危组急淋则在CR2后；慢性粒细胞性白血病在慢性期的早期(发病一年以内)，而重型再生障碍性贫血应尽早移植。(3)无急慢性感染病灶。(4)左心室射血指数＞5.0、用力肺活量(forcedvitalcapatity)≥60%、一氧化碳弥散能力(DLCO)≥50%。(5)血肌酐＜110μmol/L(2mg/dl)和总胆红素＜18μmol/L(＜2mg/dl）。（二）供者选择:首选HLA配型相合的同胞兄弟姐妹为供者,如有两个以上供者应选择与患者ABO血型或性别相同者。也可选择单倍型相同的家庭成员作为供者。选用HLA表型相同或相似的无关人员作供者,由于HLA的高度多态性,使其概率甚小。三、同种异基因骨髓移植(Allo-BMT)和同种同基因骨髓移植(SBMT)（一）移植步骤:1.供受者红细胞血型检测及HLA配型,应用PCR进行HLA-A、B、C、DR抗原分型,且HLA相同供受者进行混合淋巴细胞培养和淋巴细胞毒交叉试验。2.供者准备:详细询问供髓者的病史和全面体检，对血、骨髓及心、肝、肾、免疫功能等进行检查。骨髓检查包括常规分类、粒-单集落形成测定(GM-CFU)、染色体分析,此外还应检查血清巨细胞病毒等病毒抗体滴度和华康氏反应。如为同性供者应查红细胞同工酶和血型(包括亚型),以此作为移植后骨髓是否植入的依据。另外，供髓前4周开始采用自体血保存法储备自体血600～800毫升。3.受者准备预处理前应仔细体检；进行痰、尿、粪便、皮肤、耳、鼻、咽拭子细菌、真菌培养；预处理前一周开始口服肠道抑菌剂,；洗必泰液漱口,洗必泰甘油涂鼻、外耳道,利福平眼药水滴双眼等；注意肛周清洁卫生。实验室检查主要包括骨髓、血及心、肺、肝肾功能等检查。除做与供者相同的项目外,还应查肺功能、X线胸片、如有条件者可做有关内分泌方面的检查。入层流室当天剪指甲,剃尽全身毛发,清洁淋浴后用洗必泰液药浴20～30分钟,着无菌衣、帽、口罩,用无菌单包裹送入无菌层流室。入室后保持无菌环境,进无菌饮食,热量、蛋白质和维生素补充要足够。工作人员严格进行反向隔离。4.骨髓移植前预处理预处理目的是抑制受体免疫系统,不使移植的供体造血干细胞被受体所排斥。各疾病预处理的方案很多。(1)再障和非肿瘤性疾病:①方案一:单一环磷酰胺(CTX)静滴。②方案二:环磷酰胺和全身照射(CTX+TBI）。(2)白血病:①方案一CTX+TBI②方案二:CTX+柔红霉素+TBI骨髓采集在手术室内对供者进行骨髓采集。一般应用硬膜外麻醉,采髓部位以骼后上棘为最佳,也可在骼前上棘或/和胸骨或/和棘突部位,儿童则需加胫骨处,以多点和不同深度采髓,每点采10～15ml骨骼血,总量10～15ml/Kg(600～1000ml)。移植骨髓所需的有核细胞数应按受（患）者体重和根据供体来源而定：（1）SBMT需3.0-5.0×107/Kg（2）Allo-BMT需》2.0-6.0×108/Kg当采集到400ml时,应开始回输事先采集的自身贮备血,以防休克,术后需补充各种造血因子。（2）过滤通过17、18号针头二次过滤,或不锈钢网(孔径0.201～0.307mm)过滤后注射至血袋或采集瓶中。一般吸取的骨髓用生理盐水或1640稀释液肝素抗凝,每毫升骨髓血需含肝素15～20单位，以防骨髓血凝集。（3）骨髓回输★从受者锁骨下大静脉插管内输入。★输入前将装有骨髓血的采血袋或采集瓶倒置半小时,使骨髓中脂肪浮于上层,输注即将结束时,弃去浮在上层的脂肪滴,以防发生脂肪栓塞。★输毕后须应用采髓时所用肝素剂量的同等剂量鱼静蛋白(1mg鱼精蛋白中和100u肝素)。（二）Allo-BMT骨髓植活标准（1）植活的直接证据：★受者体内出现供者型的性染色体，标记型染色体，★HLA（I、II、和III类）抗原，红细胞、粒细胞和血小板抗原，★红细胞与白细胞同工酶，同种异型免疫球蛋白以及其它基因标记等。（2）植活的间接证据：受者发生急、慢性GVHD。（3）骨髓重建的证据：移植后2－4周，受者网织红细胞、粒细胞、淋巴细胞和血小板迅速增高，并逐渐重建造血免疫功能。四、自身骨髓移植（一）自身骨髓的采集和保存骨髓的采集在手术室内予以硬膜外麻醉下进行，儿童则采用全身麻醉。穿刺部位选择在左、右前后髂上棘和胸骨，儿童可选择胫骨上端等部位。ABMT需有核细胞总数5.0～30.0×109（0.5～5.0×108/kg体重），骨髓粒系祖细胞（CFU－C）平均1.0～4.0×104/kg体重。骨髓液按等量比例与保养液混和，经不同孔径（0.201～0.307mm）的不锈钢滤网，滤去骨髓中脂肪颗粒和碎片。在混有红细胞和骨髓液中每亳升加入肝素15-20U，4℃保存36～48小时后回输。也可应用10％二甲亚砜作为骨髓冷冻保护剂，使骨髓保存于－196℃的液氮中。（二）骨髓净化目前国际上将净化方法分为两大类：即负净化也称阴性选择：将肿瘤细胞从移植物中清除掉；正净化也称阳性选择：将正常造血干细胞从移植物中分离纯化。临床上应用方法多为负净化。但无论是物理学、生物学或其他方法都还不够理想。（三）自身骨髓移植前预处理ABMT的预处理目的是：①使骨髓产生一定空间，使造血干细胞有植入和增殖的场所；②进一步清除体内肿瘤细胞。精典的方案CTX加全身照射（TBI）或分次全身照射（FTBI）进行预处理。肺需要适当屏蔽。（四）骨髓回输：同前（五）自身骨髓移植后造血功能恢复（植活标志）ABMT后外周血白细胞从无恢复到1.0×109/L平均需16－21天；血小板恢复50×109/L平均需14－21天，粒细胞恢复0.5×109/l，平均21天。外周血造血干细胞移植一、外周血干细移植类型外周血造血干细胞移植可分为：（1）自体外周血干细胞移植（APBSCT）（2）异基因外周血造血干细胞移植（Allo-PBSCT)。供受体选择及移植前准备同骨髓移植。二、外周血干细胞的动员与采集（一）动员在正常生理条件下，外周血干细胞数量很少，只有骨髓造血干细胞量的1～10％，因此，不能满足临床PBSCT数量的需要。常用动员剂有以下几类：1．重组人造血生长因子2．抗肿瘤化疗药物（1）最大限度地杀灭患者体内的肿瘤细胞；（2）在杀伤肿瘤细胞同时，也使正常造血细胞受到损害，但由于正常造血细胞恢复时间比肿瘤细胞短，故当骨髓抑制解除时和正常造血细胞恢复之际，外周血干细胞数量反馈性增加达25～100倍，从而起到了造血干细胞动员效果。国内常用药物有环磷酰胺；阿糖胞苷。采集前动员方案选择要根据恶性肿瘤的类型和患者的具体情况而定。白血病或恶性淋巴瘤晚期等血液系恶性肿瘤作自身的PBSCT时，以选择抗肿瘤化疗药物作为动员剂量为适宜。而对于Allo-PBSCT供者宜选用GM－CSF或G－CSF。（二）采集1．采集时机选择：（1）动员化疗结束后2－3周，外周血白细胞计数升至（1.0-2.0)×109/L时。倘若单用G-CSF动员宜在白细胞计数升至（5.5-10.0）×时，血小板计数50×109/L；（2）外周血CD34阳性细胞1％（正常为0.20.1％）。但采集时机仍需根据患者的当时情况而定。2．方法：运用血细胞分离机如FenwallCS3000，分离3－4次或COBESPECTRA分离1－2次，直至采集到造血功能重建所需的细胞数。四、外周血干细胞净化净化方法有也是二种：阳性选择和阴性选择。五、外周血干细胞体外扩增为了确保PBSCT后成功的造血重建，CD34＋细胞不应低于2.5×106/kg。因此，可采用部分CD34＋细胞进行体对扩增。六、外周血干细胞的冻存通常每次经血细胞分离机分离后所得的细胞悬液约50ml，可加入等量20％二甲基亚砜（DMSO）和RDMI1640保养液，使DMSO的最终浓度调整至10％。然后分装于血液冻存袋内（每袋100ml）。采取二步降温法：第一步先1℃/min速率降至－45℃，第二步则以5～10℃/min降至－80℃～－90℃，程序结束后，最后将样品置于－196℃液氮中贮存。当需要应用时，回输前将冻存的外周血干细胞悬液立即置入40～42℃水浴中3min内迅速解冻，然后低温离心去除含DMSO上清液。加等量RPMI1640保养液稀释，每次输注400～600ml，在1小时内静脉输完毕。七、外周血干细胞移植后植活特点外周血干细胞移植后，其外周血移植后中性粒细胞（PMN）上升常出现二个峰值。第一次峰值即在PMN恢得到0.5×109/L，平均出现在移植后11天，随后呈一度下降趋势，然后约在第3～4周时再次出现第二峰值，至后白细胞恢得正常。目前认为第一次PMN峰的出现是由于外周血中较晚造血祖细胞增殖分化的结果；第二次峰值的出现则是由于较原始造血干细胞增殖分化的结果。而血小板升至50.0×109/L平均时间为13天。脐血造血干细胞移植70年代发现脐血中含有丰富造血细胞、其数量和质量与骨髓相似。80年代末则用脐血代替骨髓行造血干细胞移植获得成功。因此许多国家相继建立脐血库，我国也正在筹划之中，以期有可能解决异基因造血干细胞移植中遇到的一些难题。一、脐血的采集脐血可通过脐静脉穿刺收集，有两种方式：(1)胎盘娩出前收集；(2)胎盘娩出后收集。采集脐血时，可用肝素、ACD（枸橼酸、枸橼酸盐和葡萄糖）和CPD（枸橼酸盐、磷酸盐和葡萄糖）作为抗凝剂。每个胎盘可采集量为42－24