临床基因扩增检验培训班-PCR污染与预防

聚合酶链式反应及其污染与预防污染的措施协和医院李一荣临床基因扩增检查验收中存在的问题•5份标本(2份标本小于最低检测限)•检测结果:(1)与预期靶值完全符合(2)阴性对照出现阳性，小于最低检测限的标本为阳性(3)阳性标本高于预期值2个数量级.(4)所有阳性标本均低于预期靶值1个及以上数量级.聚合酶链式反应成功的关键因素•保证标本质量与模板质量•PCR反应体系与反应条件的优化•PCR相关仪器的校准•灵敏度、特异性•批内与批间检测的可重复性•预防污染的发生(假阳性)StephenABetal.Real-timereversetranscriptionPCR(qRT-PCR)anditspotentialuseinclinicaldiagnosis.ClinicalScience(2005)109,365–379标本质量与模板质量RealtimePCR，2006认真分析标准曲线观察PCR反应体系与反应条件是否正确1.相关系数（r2）：越接近1越好2.斜率（slope）：-3.1~3.6（100%的扩增效率）3.截距（intercept）：33.3~36.5（100%的扩增效率）Ct=A+Blg[C]Ct3733123斜率=-3.5斜率=-2.0标准曲线的要求扩增效率：通常要求达到90%~100%，如小于90%，必须重新优化。对应的斜率{［10（-1/斜率）］-1}为-3.1~-3.6。截距（灵敏度）：33.3~36.5（100%效率）相关系数：检测标准品稀释的准确性与加样的准确性（≥0.99）RealtimePCR，2006•斜率增加：（1）标准品为非线性的质粒。（2）反应体系与反应条件未优化好。（3）存在Taq酶的抑制剂或Taq酶的活性下降。（4）加样不准确斜率降低：污染或加样不准确。截距增加：（1）标准品的浓度不正确。（2）标准品降解（反复冻融或未加载体DNA的低浓度标准品）截距降低：（1）标准品的浓度不正确。（2）污染。PCR相关仪器的校准批内与批间检测的可重复性TBDNA（+）污染Why？•方法本身？•实验人员？•实验场地？•实验试剂？聚合酶链式反应与诺贝尔化学奖美国科学家KaryB.MullisKaryB.Mullis与聚合酶链式反应“我感激诺贝尔评奖委员会，在我还能够尽情享受生活的年龄及时地把诺贝尔奖授予给我”PCR的污染源•交叉污染。•来自试验材料。•“遗留”(carryover)污染。PCR去污染（decontamination）的措施•停止试验，寻找污染源。•抛弃所有可疑的试剂。•工作区间彻底的清洁消毒。•更换实验设备。•改用另一对引物，扩增靶DNA的不同区域。PCR的基本步骤与污染的发生•Reagentpreparation•Specimenpreparation•Amplification•Detection•ResultsCalculation预防污染的措施•建立标准的PCR实验室，将PCR的不同过程在不同的区间进行。为污染控制策略的核心部分。•酶法防止PCR产物的遗留污染。•表面紫外线照射减少PCR的污染。•用化学加合物如异补骨脂素将单链或双链DNA衍生化，这些加合物可防止污染的DNA作为反应的底物。标准实验室的组成及其功能（1）•前PCR区（Pre-PCRlaboratory）：又称试剂贮存与准备区，用于试剂的制备、分装、贮存以及配制PCR反应的“主混合物”反应混合物的成分Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶rTthDNA多聚酶AmpErase生物素标记的引物和或和主混合物标准实验室的组成及其功能（2）•标本处理区（Sampleprocessinglaboratory）：标本的保存，目的核酸的提取、贮存，目的核酸的添加以及cDNA的合成。Mn2+AmpErase®rTthDNAPolymeraseBiotinylatedPrimersTargetRNAorDNAReverseTranscriptiondCTPdTTPdGTPdUTPdATPBiotinylatedAmpliconBiotinylatedAmplicon标准实验室的组成及其功能•PCR扩增区（PCRamplificationlaboratory）：DNA或cDNA的扩增。•PCR产物分析区（PCRproductanalysislaboratory）：又称后PCR区，PCR产物的检测与分析。Step2.DenaturationandHybridisationDenaturationBSABSAAMPLICONAMPLICONDenaturedStrandsBiotinHybridisationCaptureProbelinkedtoBSAStep3.BindingofaAv-HRPConjugateandAdditionofSubstrate(Incubateat37C)CaptureProbeMagneticMicroparticlesAvidin-horseradishPeroxidaseConjugateBiotinAmpliconTetramethylbenzidine(TMB)SubstrateMMPMMPTMBHydrogenPeroxideoStep4.StopSolutionAdditionandAbsorbanceMeasurementAddStopSolutionandMeasureAbsorbanceCaptureProbeMicrowellPlateAdditionofSubstrateTetramethylbenzidine(TMB)SubstrateBiotinBSAAMPLICONBSAAMPLICONHydrogenPeroxideAvidin-horseradishperoxidase(Av-HRPconjugate)标准实验室的基本规章制度•所有进入ＰＣＲ实验室的人都要遵守该制度。•明确试验目的是否与实验室功能一致。•明确试验中的不确定因素。物流和人流•单向流动的原则。•从“干净”的实验室到“脏”的实验室工作服•(1)在实验室指定区域内更换指定的工作服。•(2)实验室中应频繁更换手套。•(3)一次性实验室用品(包括一次性手套与鞋套)应丢弃到生物危险废料容器中。•(4)工作衣不能穿出指定的实验室外。实验室卫生•实验室设备必要时应用10%漂白剂清洗。•所有实验室废物均应按照生活垃圾、医用垃圾、尖锐状废料以及破碎的玻璃器皿进行分类，尤其是感染性废料必须高压消毒后方能丢弃。防护罩/超净工作台•工作前，工作台表面应用75%酒精擦拭台面，紫外灯消毒，•工作后，把物品移出，用75%酒精擦拭台面，并打开紫外灯消毒。几点建议•(1)所有试剂与样品准备过程中应使用一次性灭菌的管子与瓶子•(2)每次实验应设阴性对照.•(3)将标准品与阳性对照直接储存在标本处理区，标准品的稀释(管子离心后5min打开,以避免气溶胶的产生。不能剧烈振荡标准品与阳性对照)•(4)正确使用微量加样器•(5)定期用10%的次氯酸钠清洁微量加样器与工作台面•(6)换气设备应正常工作.三、酶法防止PCR产物的遗留污染•限制性核酸内切酶法。•修饰引物，使扩增产物被某种酶切割。•UNG消解法UNG消解法原理•1）在PCR反应体系中加入UNG，并用dUTP替代dTTP，扩增产物含有dUTP。•2）UNG可以去除遗留污染DNA中的dU，DNA聚合酶会在这些位点处停滞。•3）无dU的位点是热不稳定的，在热循环中会发生断裂。以dUTP替代dTTP的PCR扩增产物，“”表示dUTP再次扩增，扩增体系加入UNG，37度10分，可消去dU。95度10分钟，DNA在无dU的区域断裂，因此遗留的DNA不能被扩增UNG消解法的缺点•短于100bp的PCR产物不能用UNG完全消除污染，四、表面紫外线照射减少PCR污染的原理•紫外线(Ultraviolet、UV)诱导DNA的损伤是通过在相邻的嘧啶碱基(CT、TT、TC、CC)之间形成环丁烷环而发生的，环丁烷环形成链内的嘧啶二聚体，从而抑制了聚合酶介导的链延伸反应。变性退火5’3’5’3’5’5’5’3’3’紫外线照射延伸5’5’3’3’特点•需要较长的时间，不能消除所有污染，•对序列长度有一定的依赖性，当DNA片段小于300bp时效果较差。•被消毒表面应与UV光源垂直以达到最大的光强度。•靶分子被遮蔽，则失活效率不高。•UV照射具有致突变性，并可引起视力下降或致盲。去污染方法•紫外灯在工作区不使用的所有时间内始终打开。•使用后将紫外灯打开以消除工作空间的污染。再次准备工作之前再将紫外灯关掉。•紫外线照射时间依具体情况而定。结论•紫外线照射是其他适当技术的辅助手段.，为保持PCR实验室的无污染提供额外的安全保证。谢谢