2017-01-15-酵母表达系统-陈凯

酵母表达系统汇报人：陈凯汇报时间：2017-01-15主要内容一、酵母表达系统的种类；二、酵母的表达载体；三、酿酒酵母表达系统；四、毕赤酵母表达系统；五、毕赤酵母表达系统中外源基因表达优化。酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。（可有性繁殖）一、酵母表达系统的种类1、酿酒酵母表达系统；2、甲醇营养型酵母表达系统---巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母；3、裂殖酵母表达系统；4、乳酸克鲁维亚酵母表达系统；5、Arxulaadeninivorams。二、酵母的表达载体酵母表达载体依据其复制形式分为自主复制型和整合型两种。1、游离质粒载体指带有自主复制序列（ARS）的复制型质粒和带有酵母内源质粒2μ环的衍生质粒载体。它细分为三种：①酵母附加型质粒（YEp）----拷贝数高较稳定；②酵母复制质粒（YRp）-----拷贝数高但不稳定；③酵母着丝质粒（YCp）----每个细胞平均只有一个拷贝，稳定。2、整合载体整合载体（yeastintegrationplasmid，YIp）指不含酵母自助复制序列，不能独立复制的载体，但含有整合介导区，可通过同源重组整合入酵母基因组并随同酵母染色体一起复制。三、酿酒酵母表达系统酿酒酵母是目前了解最完全的真核生物，1996年完成全基因组测序，是一种真核生物模式菌，被FDA认定为安全性生物。1、常用的启动子1）糖酵解途径中关键酶的启动子：甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PGK、乙醇脱氢酶基因ADH；2）半乳糖激酶启动子：GAL1；3）pho4TS-PHO5启动子。2、酿酒酵母分泌系统1）信号肽结构：2）常用分泌信号肽：①性结合因子---MF-α；②酸性磷酸酯酶---PHO5；③蔗糖酶---SUC2；④杀手毒素因子KIL。3）信号肽特点：①保守性低；②大多异源宿主系统的信号肽不能互用；4）MF-α信号肽：①由88个AA组成；②分泌效率高；③在酵母系统具有通用性。3、酿酒酵母糖基化系统1）糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）2）糖基化类型：①N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。②O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化。3）糖基化特点：过糖基化（超糖基化修饰）4、酿酒酵母表达系统缺点：1）对产物的翻译后修饰与高等真核生物不同，常发生超糖基化（N-糖基链上出现100个甘露糖，是正常的十几倍）；2）不易进行高密度发酵，表达产物产量低；3）分泌效率低，30KDa的蛋白几乎不分泌；4）表达的蛋白C端易被截断；四、巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养型酵母，是80年代开发和研制的一种外源蛋白高效表达系统。1、特点●含醇氧化酶基因（AOX）强启动子，用甲醇可严格调控外源基因的表达；●外源蛋白基因遗传稳定；●自身分泌的背景蛋白少；●表达水平高，即可胞内表达又能胞外表达；●具有翻译后修饰系统（糖基化、磷酸化、脂酰化）；●使用简单，成本低廉；●可高密度发酵，且发酵工艺成熟，易放大；2、宿主细胞目前广泛应用于外源基因表达和研究的毕赤酵母宿主菌有两种主要类型：营养缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌。1）营养缺陷型菌株2）蛋白酶缺陷型菌株3、表达载体由于毕赤酵母没有稳定的游离型载体，故应用整合型载体，通过同源重组整合到酵母染色体来实现稳定表达。分泌表达型载体pPICZαAEcoRI、XbaI、KpnI……HIS4α-Factor，Zeoncin胞内表达型载体常用启动子4、转化及筛选鉴定①表达载体的线性化②感受态细胞的制备③转化④营养缺陷筛选（His）⑤抗性筛选（G418）⑥鉴定（菌落PCR或表达）（1）表达载体的线性化未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，故需使用特定的限制性内切酶进行线性化处理。处理的目的：1）防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活；2）让同源重组以指定的方式发生。（2）转化方式（3）目的基因的整合方式1）基因插入AOX1或aox1::AGR4位点2）基因替换AOXI位点3）基因插入HIS4位点4）多拷贝插入（4）筛选1）组氨酸缺陷平板初筛毕赤酵母菌GS115及KM117在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变，因而不能合成组氨酸。转入的质粒含HIS4基因可与宿主互补，通过MD筛选培养基即可选择转化子。2）G418平板筛选多拷贝质粒上含有细菌的Kana基因（其与表达盒之间有遗传连锁），赋予毕赤酵母遗传霉素抗性。遗传霉素抗性水平主要依赖整合的kana基因的数目；每个单拷贝的基因赋予毕赤酵母约0.25mg/ml的遗传霉素抗性水平。五、外源基因表达优化1、基因拷贝数（基因剂量）：目的基因的拷贝数对表达量影响极大，不同的基因对拷贝数的要求不同。因此，实验时要对不同拷贝的菌株进行表达量筛选。2、基因序列组成：①A+T含量高的基因在酵母中由于提前终止而不能有效的转录[序列TAAATAAA/G是酵母的poly（A）识别信号]。因此控制其含量在30%~55%之间是切实可行的方法。②mRNA的5‘-UTR长度及其核苷酸序列对外源基因在酵母中的表达影响很大。因此目的基因的5’-UTR与AOX1基因的（114个AA，AT含量为73%）必须保持尽可能的接近，最好完全符合。3、密码子优化：各物种存在这密码子偏爱性的现象，因此采用酵母偏爱的密码子可显著提高表达量；4、启动子：选择启动子时,必须依据研究目的和外源蛋白的性质来选择最合适的启动子,有时并不是启动子越强越好,合理选择与设计启动子是提高外源蛋白产量的有效途径。5、糖基化修饰：毕赤酵母的糖基化修饰作用对外源蛋白的表达量和蛋白性质都有影响。其糖基化程度虽比酿酒酵母弱，但与天然蛋白相比，仍存糖基化过度问题。因此在不影响功能的情况下，定向突变糖基化位点、或选择与糖苷酶进行共表达，来解决该问题。6、信号肽：根据不同结构及性质的外源蛋白选择适当的信号肽并进行相应改造，以期实现高效表达。7、外源蛋白的降解：1）培养基中加入富含氨基酸和多肽的添加剂（蛋白胨和酪蛋白水解物)；2）调节培养基pH值以降低蛋白酶活性；3）添加蛋白酶抑制剂（PMSF、EDTA）；4）使用蛋白酶缺陷菌株；共表达蛋白水解酶抑制剂5）共表达蛋白水解酶抑制剂（如分泌型白细胞蛋白酶抑制因子—SLPI）；6）利用过氧化物酶体靶向信号(Peroxisomaltargetingsignal，PTS)与目的蛋白连接；7）在不改变重组蛋白性质的前提下，去除蛋白酶的作用位点；8）利用在毕赤酵母中稳定的蛋白伴侣与目的蛋白融合表达，可明显地提高表达量（如二硫键异构酶PDI。甲醇的代谢途径